[发明专利]一种肠道病毒疫苗的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种肠道病毒疫苗的制备方法。

(二)背景技术

手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括CoxA5，A10，A16，A19，EV71，以及部分埃可病毒和柯萨奇B组病毒，以CoxA16和EV71最为常见。

肠病毒71型(EV71)是属人肠病毒属，小RNA病毒科，是手足口病的主要病原之一。婴幼儿感染后引起手足口及疱疹性咽峡炎，少数可发生无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿及急性弛缓性瘫痪等并发症，出现严重的神经系统、呼吸系统及循环系统症状。自1969年首次在美国加利福尼亚分离出病毒以来，全世界经历多次EV71的暴发流行。1997年以来，感染EV71的人数显著增加，特别在亚太地区，1997年马来西亚EV71感染约6000人，30多名儿童死亡，平均年龄1.5岁。1998年台湾共报告129106例手足口感染，405名为严重中枢神经系统感染，78例死亡。2008年春季，我国安徽阜阳暴发手足口疫情，78名儿童死亡，近万人感染，引起了社会各界的普遍关注。我国卫生部自2008年5月，将该病列入法定报告传染病报告病种。近几年来，手足口病传染流行越来越广泛，尚未有有效的药物及疫苗可用于该病的治疗与预防。

目前已有多家研究单位研究EV71疫苗，但尚有一些不能令人满意的地方。目前用于生产EV71疫苗的基质细胞可分为二类：一类是二倍体细胞，主要是人胚肺细胞；一类是Vero传代细胞。前者，EV71病毒在此二倍体细胞中繁殖滴度低，产量受到限制，扩大生产比较困难；对于后者，由于Vero细胞是传代细胞，疫苗中所含的传代细胞DNA含量需要在30ng以下，但去除病毒液中的DNA又较困难，导致生产成本较高、效率较低。因此，生产EV71疫苗的基质细胞尚需改进。

(三)发明内容

本发明目的是提供EV71、CoxA16等肠道病毒疫苗的制备方法。

本发明采用的技术方案是：

一种肠道病毒疫苗的制备方法，所述方法包括：

(1)取10～15天龄的沙鼠，处死，无菌取下肌肉组织(主要是骨骼肌)，剪碎，以含100U/ml卡那霉素的细胞培养液洗2次，去尽洗液；

(2)肌肉组织加10倍质量的含0.2％(w/v)胶原酶II、0.25％(w/v)胰蛋白酶的消化液，4℃消化过夜；w/v表示质量体积百分比浓度，某组分浓度1％表示100mL溶液中该组分含量为1g；

(3)终止消化后弃去消化液，加质量为肌肉组织质量10倍的细胞培养液反复吹打，分散细胞，依次过100、200和400目的不锈钢滤网，收集滤液，离心，弃上清液，沉淀细胞用细胞培养液重新悬浮，加新生牛血清至其终浓度为10％(v/v)，接种至细胞瓶，36℃培养箱中培养；

(4)差速贴壁2h后，吸取细胞上清液，接种新培养瓶，36℃培养至细胞生长达到70％～80％融合时，换含5％(v/v)新生牛血清的细胞培养液继续培养，当细胞达到95％融合时，用于病毒接种；

(5)取95％融合的肌肉单层细胞培养瓶，弃培养液，接种病毒滴度为1×10^3.0～5×10^3.0TCID₅₀的含肠道病毒的病毒液，置35℃培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，加含1％(v/v)新生牛血清、100U/ml卡那霉素的细胞培养液，35℃培养细胞出现病变(表现为细胞皱缩、变圆和脱落)，收获上清液(此为第2代病毒)；

(6)收获的上清液作为病毒液接种至新制备的95％融合的肌肉单层细胞，按步骤(5)重复操作4～5次，直至收获的上清液中病毒滴度大于1×10^6.0TCID₅₀(EV71经单层沙鼠肌肉细胞中连续传代5～6代后，细胞病变出现的时间可由原来的10天左右缩短至3天左右；病毒滴度可由原来的1～5×10^3.0TCID₅₀提高至1×10^7.0TCID₅₀以上)，离心去除细胞碎片，加10％(v/v)新生牛血清，再加病毒液2倍体积量的脱脂牛奶，即为病毒毒种，分装后，-80℃保存备用；

(7)取步骤(6)病毒毒种，接种至新制备的95％融合的肌肉单层细胞培养瓶，置35℃培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，用细胞培养液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的无牛血清的细胞培养液，35℃培养2～3天，收获病毒上清液；