[发明专利]一种肠道病毒疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种肠道病毒疫苗的制备方法，所述方法包括：

(1)取10～15天龄的沙鼠，处死，无菌取下肌肉组织，剪碎，以含100U/ml卡那霉素的细胞培养液洗2次，去尽洗液；

(2)加肌肉组织10倍质量的含0.2％胶原酶II、0.25％胰蛋白酶的消化液，4℃消化过夜；

(3)终止消化后弃消化液，加质量为肌肉组织质量10倍的细胞培养液反复吹打，分散细胞，依次过100、200和400目的不锈钢滤网，收集滤液，离心，弃上清液，沉淀细胞用细胞培养液重新悬浮，加新生牛血清至其终浓度为10％，接种至细胞培养瓶，置36℃培养箱中培养；

(4)差速贴壁2h后，将上清悬浮细胞转移至新的细胞培养瓶，36℃培养至细胞生长达到70％～80％融合时，换含5％新生牛血清的细胞培养液继续培养，当细胞达到95％融合时，用于病毒接种；

(5)取95％融合的肌肉单层细胞培养瓶，弃培养液，接种病毒滴度为1×10^3.0～5×10^3.0TCID₅₀的含肠道病毒的病毒液，置35℃培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，加含1％新生牛血清、100U/ml卡那霉素的细胞培养液，35℃培养至细胞出现病变，收获上清液；

(6)收获的上清液作为病毒液接种至新制备的95％融合的肌肉单层细胞，按步骤(5)重复操作4～5次，直至收获的上清液中病毒滴度大于1×10^6.0TCID₅₀，离心去除细胞碎片，加10％新生牛血清，再加病毒液2倍体积量的脱脂牛奶，混匀，即为病毒毒种，分装后，-80℃保存备用；

(7)取步骤(6)病毒毒种，接种至新制备的95％融合的肌肉单层细胞培养瓶，置35℃培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，用细胞培养液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的无牛血清的细胞培养液，35℃培养2～3天，收获病毒上清液；

(8)所得病毒上清液灭活后，经10万分子量孔径的超滤膜浓缩，再过Sepharose或Sephacryl凝胶柱层析，收获第一峰，即为疫苗原液；疫苗原液经PBS稀释使抗原量为1∶160，按0.5％比例加人血白蛋白，得疫苗半成品，疫苗半成品再经检验、分装，即为疫苗成品；

步骤(1)～(7)中，所述细胞培养液为下列之一：MEM培养液，F10培养液或F10/DMEM培养液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述肠道病毒为肠道病毒EV71或CoxA16。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)～(7)中所述细胞培养液为MEM培养液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述疫苗为EV71与CoxA16双价疫苗，将肠道病毒EV71和CoxA16分别按步骤(1)～(8)方法制得疫苗半成品，再按比例混合，经检验、分装后，得到EV71与CoxA16双价疫苗成品。