[发明专利]在牛MSTN基因中引入移码突变的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域的基因工程技术，涉及一种通过基因打靶技术在牛MSTN基因中引入移码突变的方法，该移码突变是MSTN基因第4843bp到第4853bp共11bp缺失导致的。

背景技术

生长/分化因子-8(growth/difference factor-8，GDF-8)是1997年美国JohnHopkins大学医学院的Mepherron和Lee等研究小鼠的转化生长因子β(TGF-β)超家族时发现的一种新的蛋白质因子基因，他们将这一基因命名为生长/分化因子-8，即GDF-8。通过试验研究表明：GDF-8正常情况下编码一种蛋白，这种蛋白呈现出骨骼肌生长的负调控因子活性，从而把它称为肌生成抑制素(myostatin，即MSTN)。

牛的MSTN基因位于2号染色体着丝点与微卫星标记(TGLA44)之间，距离着丝点微卫星标记(BTA2)约2～3cm，它是骨骼肌生长发育的负调节因子，属于TGF-β超家族成员，为不完全显性遗传。该基因含有2个内含子和3个外显子。第1个外显子与第2个外显子的长度分别是506bp和374bp；第3个外显子的长度因poly(A)尾巴位点的不同而有所不同(1701bp、1812bp或1887bp)。两个内含子的长度分别为1840和2033bp。外显子与内含子连接区域序列遵守GT-AG规则。

MSTN基因在不同物种间有高度的保守性。McPheffon和Lee以小鼠MSTN保守的C-末端编码序列为探针，对小鼠、大鼠、人、牛、猪、羊、鸡、火鸡及斑马鱼的MSTN的cDNA进行了克隆和测序，结果表明，各种动物的MSTN序列高度保守，其N-末端都有分泌必须的信号肽序列，都有类胰蛋白酶作用水解加工位点(RSRR)，都含有TGF-β的超家族的富含半胱氨酸的保守区，并且在大鼠、小鼠、人、猪、鸡及火鸡的水解加工位点后的C-末端完全相同，同源率为100％。而牛、绵羊、狒狒的成熟蛋白中也仅有1～3个氨基酸不同；斑马鱼的MSTN的基因序列保守性较差，与其他动物的C-末端的同源性为88％。

当该基因发生突变后，myostatin失活，失去生理功能。MSTN的生理功能是限制骨骼肌的生长，当它发生突变之后，这种限制作用就消失了，然后肌肉就表现过度发育，不仅肌纤维数目增多(hyperplasia)，而且直径也增大(hypertrophy)。牛的肌肥大症又称肌纤维增生症(myofibrehyperplasia，MH)或双肌症(double muscling，DM)，是由持续提高胴体品质的选育所产生的一种肌纤维肥大和骨骼肌数量增加的遗传突变表型。比利时兰牛(Belgian Blue)是一种典型的具有双肌表型的牛。Lee Se-Jin等对比利时兰牛的MSTN基因外显子进行了PCR扩增、克隆和序列测定。结果表明，比利时兰牛的MSTN基因发生了突变，在外显子3上缺失了11个核苷酸，导致此位点后阅读框架发生改变，并在此点后的第14个密码子处终止了阅读框架，从而使MSTN被截短。这种缺失位于C-端区第7个氨基酸上，使得MSTN失去了102个氨基酸，因此，翻译出的是一个截断的蛋白，不能发挥其抑制肌肉生成的生物学功能，从而表现出双肌症状。

双肌牛的表型特征是臀部、大腿、上臂、胸及起支撑作用的中前段肌肉群异常发达，皮下脂肪少，且有更多的脂肪沉积于肌纤维之间，皮肤薄，这些变化恰好符合人们所追求的高瘦肉率、肉质香嫩的育种目标。在生产中用双肌牛做终端父本所杂交改良的品种已经给人们带来了巨大的经济效益。

发明内容

鉴于MSTN基因的移码突变对产肉性状的影响，本发明的目的在于提供一种通过基因打靶将移码突变引入牛MSTN基因组中的方法，借助此方法可以得到拥有双肌症状的转基因牛，以改善其产肉性状，借此提高牛肉的品质与产量。

本发明的技术方案如下：

一种在牛基因中引入MSTN基因移码突变的方法，包括以下步骤：

(1)带有移码突变的牛MSTN基因同源短臂的构建：

合成构建的同源短臂是从牛MSTN基因第4741bp到第6681bp，包括部分内含子2和绝大部分的外显子3，但在第3外显子上缺失第4843bp到第4853bp，共11bp。得到的同源短臂共1930bp，并在其5’端引入了一个Xba I酶切位点，3’端引入了一个Pme I酶切位点。

(2)牛MSTN基因同源长臂的构建：

合成构建的同源长臂是从牛的MSTN基因的第1bp到第4740bp，包括1、2外显子，内含子1及部分内含子2，共4740bp，并在其5’端引入了一个Pac