[发明专利]在牛MSTN基因中引入移码突变的方法

权利要求书

1.一种在牛MSTN基因中引入移码突变的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)带有移码突变的牛MSTN基因同源短臂的构建：

合成构建的同源短臂是从牛MSTN基因第4741bp到第6681bp，包括部分内含子2和绝大部分的外显子3，但在第3外显子上缺失第4843bp到第4853bp，共11bp。得到的同源短臂共1930bp，并在其5’端引入了一个Xba I酶切位点，3’端引入了一个Pme I酶切位点；

(2)牛MSTN基因同源长臂的构建：

合成构建的同源长臂是从牛的MSTN基因的第1bp到第4740bp，包括1、2外显子，内含子1及部分内含子2，共4740bp，并在其5’端引入了一个Pac I酶切位点，3’端引入了一个Not I酶切位点；

(3)打靶载体的构建：

①用Pac I和Not I双酶切所述同源长臂及pFPC-1载体，通过连接酶连接，使所述同源长臂插入质粒载体pFPC-1的Pac I和Not I酶切位点；

②用Xba I和Pme I双酶切所述同源短臂和步骤①获得的插入有同源长臂的质粒载体pFPC-1，通过连接酶连接，使所述同源短臂插入到Xba I和Pme I酶切位点，得到打靶载体pFPC-MSTN；

(4)牛MSTN基因移码突变的引入：

①用Pac I或Pme I单酶切处理所述打靶载体pFPC-MSTN使其线性化，用脂质体转染试剂转染牛体细胞，同源重组后使筛选标记基因Neo-TK及移码突变引入牛MSTN基因中，用G418和DTA特性对成功进行同源重组的细胞株进行筛选；

②用含有重组酶Cre基因的腺病毒载体转染293细胞，进行病毒包装，通过反复冻融转染293细胞收集病毒，利用收集的病毒感染步骤①所得的筛选后的细胞株，用Cre酶的活性删除loxp位点当中的筛选基因Neo-TK，用GANC筛选出成功删除Neo-TK后的细胞株；在牛基因中引入了MSTN基因移码突变。

2.根据权利要求1所述的在牛基因中引入MSTN基因移码突变的方法，其特征在于：所述步骤(3)的①步中是用胶回收酶切产物得质粒载体pFPC-1；②步中是用胶回收酶切产物得到打靶载体pFPC-MSTN，然后通过转化大肠杆菌DH5α，酶切鉴定连接效果。

3.根据权利要求1所述的在牛基因中引入MSTN基因移码突变的方法，其特征在于：所述步骤(4)的①步中的用G418和DTA特性对成功进行同源重组的细胞株进行筛选是转染后24-40小时加入G418对同源重组细胞进行筛选。

4.根据权利要求1所述的在牛基因中引入MSTN基因移码突变的方法，其特征在于：所述步骤(4)的②步中的用含有重组酶Cre基因的腺病毒载体转染293细胞是：首先构建含有重组酶Cre基因的载体pAdTrack-CMV，获得质粒载体pAdTrack-Cre；然后将骨架载体pAd-Easy-1转化BJ5183菌株，获得pAd-Cre载体；然后利用Pac I酶切线性化载体pAd-Cre，转染293细胞。