[发明专利]肝癌早期预警和筛查试剂

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种可用于肝癌早期预警和筛查的试剂及以其为组成部分制成制备的试剂盒。

背景技术

人原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，由于其预后非常差，成为癌症死亡的第三大原因。HCC在非洲的西部和中部、亚洲的东部和南部发病率最高，其中仅中国发病患者占55％，近年在美国的发病率也逐渐升高。中国高发的主要危险因素是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的慢性感染，大多数患者的发病进展过程表现为慢性肝炎(chronic hepatitis，CH)、肝硬化(liver cirrhosis，LC)到HCC的发展进程。中国每年大约有25万人死于肝癌，位居癌症死亡原因的第二位，是严重威胁人类健康的恶性疾病。

HCC患者，通常由于诊断较晚而预后很差，事实上80％以上肝癌患者被诊断时肿瘤已进入中晚期而失去手术机会，而HCC首选的治疗方案就是肝癌切除和肝脏移植手术，因此早期诊断就显得尤为重要。然而。目前临床上早期筛查HCC的主要指标是血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平和影像学B超监测，但是一部分HCC患者血清AFP长期保持低水平(＜20ng/ml)，而B超在检测和进一步判断结节的特征时有一定的局限性，从而影响到肝癌早期诊断的灵敏性。

尽管HCC发病的分子机制尚未明确，已证实表观遗传学改变，尤其是DNA的甲基化在其发生发展中发挥重要作用。抑癌基因的基因沉默，也被认为是HCC发生的早期事件，并且有文献报道在LC中也发现抑癌基因的基因沉默。有研究认为，部分抑癌基因的异常甲基化与肝癌的发展进程密切相关，部分抑癌基因的异常甲基化在正常肝和慢性肝炎阶段未发现，肝硬化(liver cirrhosis，LC)开始出现，到HCC阶段有累加的趋势。

RASSF相关区域家族1A基因(ras-association domain family 1A，RASSF1A)是在Ras信号通路中发挥调节作用的抑癌基因。RASSF1A基因的表达可以调节细胞增殖，诱导凋亡，并能够在细胞周期中和微管相结合，增加微管蛋白的稳定性。p16是在细胞周期检测点G1-S起调节作用的抑癌基因，其表达蛋白能够结合到周期素依赖性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)从而抑制CDK4发挥作用，阻止细胞由G1期进入S期，抑制细胞过度增殖，在体内能够抑制肿瘤细胞的增殖³⁰。GSTP1(glutathione S-transferase p1)基因是一种重要的DNA损伤修复基因，属于抑癌基因，其编码的蛋白GST(谷光甘肽转移酶)π类酶属于体内II相代谢解毒酶家族，参与代谢、解毒和消除潜在具有基因毒性的外来复合物，起到保护细胞、避免DNA损伤和癌细胞形成的作用。GSTP1的表观遗传性沉默在乙肝病毒相关的肝癌中起到重要作用。E型钙粘附分子(E-cadherin)基因是一种关键的细胞粘附分子，属于抑癌基因，其表达蛋白能够与细胞骨架结合，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。已证实HCC癌组织中存在以上四个基因启动子区启动区CpG岛异常甲基化，这些基因甲基化所致的基因沉默在肝癌的发生发展中可能起着重要作用。

胚肝血影蛋白(embryonic liver fodrin，ELF)是一种新发现的β血影蛋白(3Spectrin)，在TGF-β信号通路中与Smad3/4相互作用，缺失ELF则Smad3/4不能定位。文献报道，抑癌基因ELF在正常肝组织中表达，而肝癌干细胞及肝癌组织中表达下调，并且在敲除ELF基因的小鼠中，40％自发产生肝癌，表明ELF在肝癌发生的早期发挥重要作用，但ELF在肝癌组织中表达下调的原因尚未明确。

正常人循环血液中存在少量游离DNA(约10ng/ml)，而肿瘤患者血浆DNA水平远远高于正常人(超过100ng/ml)。肿瘤患者循环血中游离DNA主要是肿瘤细胞凋亡或组织坏死后释放，并且保持有肿瘤细胞DNA的生物学特征改变。检测外周血游离DNA中基因甲基化的状态可能反应出患者肿瘤细胞的甲基化状态。鉴于理想的分子标志物应该出现在疾病发生的早期并且在无创性标本中可被检测，所以有研究致力于检测外周血浆或血清游离DNA的表观遗传学改变，但是目前关于肝癌从正常肝组织、CH、LC到HCC发展各阶段患者血浆游离DNA甲基化状态的系统性信息非常有限。肝组织活检虽为HCC诊断的金标准，但是会给患者带来较大创伤和风险，所以迫切需要寻找高灵敏度和无创性的早期检测手段。