[发明专利]解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光定量检测方法，具体涉及一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法。

背景技术

脲原体(Ureaplasma)是从人体中分离的能自身繁殖的13种支原体之一，属硬壁菌门柔膜体纲支原体目支原体科脲原体属。脲原体介于病毒和细菌之间，是在人工培养基上能繁殖的最小的原核细胞型微生物，无细胞壁，能自我复制，呈球杆状，大小为125～250nm，分子量为4.5×10⁸，具高度多形性。脲原体根据分子生物学特征分为两个生物群和14个血清型，两个生物群包括微小脲原体(Ureaplasmaparvum，Up)和解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)，14个血清型中，基因组较小的血清型1、3、6、14属于微小脲原体，占脲原体感染的90％～92％；基因组较大的血清型2、4、5、8～13属于解脲脲原体，占脲原体感染的8％～10％。

脲原体两个生物型在人群中的分布及致病性存在差异，常用的脲原体血清学分型方法操作比较繁琐，易出现交叉反应，结果难以准确判断。

因此，为了克服现有技术的缺点和不足，本发明提供一种操作简便、检测效率高的基因定量分析方法。

发明内容

本发明涉及一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法，利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术，可同时对标本中的解脲脲原体和微小脲原体两种基因进行鉴别与定量分析，获得更为准备的实验结果，该方法对样品需求量少，操作简便，检测效率高。

本发明通过以下技术方案实现：

一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，样本处理和DNA提取；

步骤二，将与解脲脲原体的拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入一个PCR扩增管中；

步骤三，将与微小脲原体的拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入另一个PCR扩增管中；

步骤四，在相同的扩增条件下，同时分别扩增上述两个扩增管中所述解脲脲原体和所述微小脲原体的DNA靶序列；

步骤五，检测所述反应体系中不同荧光信号的变化，通过标准曲线来判断待测样品中是否含有解脲脲原体、微小脲原体或混合感染，并确定其相应含量。

优选的，在所述步骤一中，所述样本处理和DNA提取的具体过程包括：将标本管置于振荡器上振荡，自管壁挤干棉试子，吸取全部液体转至洁净的离心管中，12000rpm/min离心10分钟，去上清，沉淀加入裂解液溶解，37℃保温60min，沸水浴保温5min，酚氯仿抽提法抽提DNA，提取的DNA沉淀溶于TE缓冲液。

优选的，在所述步骤二中，所述正向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列下游位点杂交；所述荧光标记探针与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应靶序列杂交。

优选的，在所述步骤二中，所述荧光标记探针的序列选自SEQ ID No.4所示的序列或其互补序列，或由该序列或其互补序列衍生出的差别不大于3个碱基的核苷酸序列。

优选的，在所述步骤三中，所述正向引物与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列下游位点杂交；所述荧光标记探针与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应靶序列杂交。

优选的，在所述步骤三中，所述荧光标记探针的序列选自SEQ ID No.8所示的序列或其互补序列，或由该序列或其互补序列衍生出的差别不大于3个碱基的核苷酸序列。

优选的，所述荧光标记探针为TaqMan探针，所述探针5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。进一步优选的，所述荧光报告基团选自FAM、TAT、JOE、ROX、VIC、TAMRA、CY3或CY5，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、DABCYL或NFQ。