[发明专利]解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法

权利要求书

1.一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一，样本处理和DNA提取；

步骤二，将与解脲脲原体的拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入一个PCR扩增管中；

步骤三，将与微小脲原体的拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入另一个PCR扩增管中；

步骤四，在相同的扩增条件下，同时分别扩增上述两个扩增管中所述解脲脲原体和所述微小脲原体的DNA靶序列；

步骤五，检测所述反应体系中不同荧光信号的变化，通过标准曲线来判断待测样品中是否含有解脲脲原体、微小脲原体或混合感染，并确定其相应含量。

2.根据权利要求1所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤一中，所述样本处理和DNA提取的具体过程包括：将标本管置于振荡器上振荡，自管壁挤干棉试子，吸取全部液体转至洁净的离心管中，12000rpm/min离心10分钟，去上清，沉淀加入裂解液溶解，37℃保温60min，沸水浴保温5min，酚氯仿抽提法抽提DNA，提取的DNA沉淀溶于TE缓冲液。

3.根据权利要求1所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述正向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列下游位点杂交；所述荧光标记探针与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应靶序列杂交。

4.根据权利要求1、2或3所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述荧光标记探针的序列选自SEQ ID No.4所示的序列或其互补序列，或由该序列或其互补序列衍生出的差别不大于3个碱基的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述正向引物与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列下游位点杂交；所述荧光标记探针与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应靶序列杂交。

6.根据权利要求1、2或5所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述荧光标记探针的序列选自SEQ ID No.8所示的序列或其互补序列，或由该序列或其互补序列衍生出的差别不大于3个碱基的核苷酸序列。

7.根据权利要求1、2、3或5所述的荧光定量检测方法，其特征在于，所述荧光标记探针为TaqMan探针，所述探针5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。

8.根据权利要求7所述的荧光定量检测方法，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、TAT、JOE、ROX、VIC、TAMRA、CY3或CY5。

9.根据权利要求7所述的荧光定量检测方法，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、DABCYL或NFQ。