[发明专利]一种参与丁醇生成的醇脱氢酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种参与丁醇生成的醇脱氢酶及其应用。

背景技术

醇脱氢酶(ADH；EC 1.1.1.1，1.1.1.2，或1.1.1.71)是生物体中丁醇、乙醇、异丙醇等代谢途径的关键酶。醇脱氢酶催化醛或酮还原生成相应的初级或次级醇，其反应式如下：醇是厌氧代谢中一种普遍产物，同时代谢中间物作为电子受体接受电子从而再生辅酶NAD(P)⁺。

超过半数的梭菌属菌可以产生一种或多种醇：如甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，n-丁醇，异丁醇(2-甲基-1-丁醇)和异戊醇(3-甲基-1-丁醇)等，其中丁醇和乙醇是最常见的两种产物。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)属于革兰氏阳性菌，GC含量30.9％，2001年完成全基因组测序。它是一类产孢子的厌氧梭菌，能发酵产生丙酮、乙醇和丁醇等溶剂。在丙酮丁醇发酵过程中，丁醇是最具经济价值的溶剂。为提高生物丁醇相对化学法生产的经济性，一方面可以开发利用廉价底物的工程菌，另一方面可以提高发酵产物中高副加值产品丁醇的比例，从而提高产物/原料转化率。一般的丙酮丁醇梭菌如ATCC 824在发酵生产溶剂的过程中，丁醇的比例约为60％左右。通过土样分离、化学诱变及抗性筛选，及代谢工程改造，敲除丙酮生成途径关键酶，产丁醇比例进一步提高到80％。

为进一步增加产物丁醇的比例，有必要进一步降低副产物乙醇的产生，对醇脱氢酶的功能鉴定就至关重要。由于醇脱氢酶的底物特异性、催化活性大小、表达量与生物丁醇/乙醇的产量紧密相关，同时醇脱氢酶与微生物细胞内重要代谢辅因子NAD(P)+/NAD(P)H动态平衡的维持关系密切。对醇脱氢酶基因、表达调控、酶学性质、蛋白质结构等方面研究对丁醇代谢工程的改造具有重要的意义。因此目前本领域迫切需要对参与调控丁醇产生的醇脱氢酶进行鉴定和功能验证。

发明内容

本发明的目的就是提供一种参与丁醇生成的醇脱氢酶及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的CA_C3375醇脱氢酶或其编码基因的用途，它被用于调节丙酮丁醇梭菌产生溶剂的能力。

在另一优选例中，所述的调节包括：上调(或提高)和下调(或降低)。

在另一优选例中，所述的溶剂选自下组：乙醇，丙酮，丁醇，或其组合。

在另一优选例中，所述的溶剂为丁醇。

在另一优选例中，所述的CA_C3375醇脱氢酶选自下组：(i)具有SEQ ID NO.：29所示氨基酸序列的多肽；(ii)将SEQ ID NO.：29所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.：29所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥97％，更佳地≥99％)、由(1)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述CA_C3375醇脱氢酶的编码基因是选自下组的一种或多种：(1)编码如SEQ ID NO.：29所述多肽的多核苷酸；(2)序列如SEQ ID NO.：1所示的多核苷酸；(3)序列与SEQ ID NO.：1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥97％，更佳的≥99％)的多核苷酸；(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

在本发明的第二方面，提供了一种提高丙酮丁醇梭菌产生丁醇能力的方法，包括步骤：提高丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脱氢酶基因的表达水平，或提高丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脱氢酶的活性。

在另一优选例中，所述的提高是指，与野生型丙酮丁醇梭菌相比，CA_C3375醇脱氢酶基因的mRNA表达水平提高10％以上，或CA_C3375醇脱氢酶的表达或活性上升10％以上。

在另一优选例中，所述的提高通过选自下组的一种或多种方式实现：导入额外的CA_C3375醇脱氢酶、引入提高CA_C3375醇脱氢酶的表达或活力的突变、或引入瞬时表达CA_C3375醇脱氢酶的表达载体。

在本发明的第三方面，提供了一种丙酮丁醇梭菌，所述丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脱氢酶基因的表达水平或CA_C3375醇脱氢酶的活性提高。

在另一优选例中，所述的提高是指，与野生型丙酮丁醇梭菌相比，CA_C3375醇脱氢酶基因的mRNA表达水平提高10-100％，或CA_C3375醇脱氢酶的表达或活性提高10-100％。