[发明专利]一种促进美达霉素生物合成的基因工程菌及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及的是提高抗肿瘤抗生素美达霉素产量的遗传育种方法，特别是一种来自纳士威尔链霉菌的核糖体再循环因子(ribosome recycling factor，RRF)的克隆以及用于抗生素美达霉素高产菌育种的方法。此链霉菌核糖体再循环因子能够促进美达霉素的积累，大大提高抗生素的生物合成效率。

背景技术：

链霉菌能产生许多有用的抗生素，但多数天然菌株产生抗生素的水平很低，限制了对抗生素的进一步开发，所以抗生素高产菌的育种一直是抗生素产业中的瓶颈。目前抗生素高产菌育种的手段有很多，包括传统的物化诱变、原生质体融合、分子诱变以及通过代谢工程进行定向遗传改造等等。

在链霉菌体内抗生素的生物合成水平受到多种调控因素的控制，包括多效调节因子(能调控不止一种代谢产物的积累，并且对细胞的分化也有调控作用)、途径专一性调控基因(调节特定途径的次生代谢)、体外信号分子等。营养物质对抗生素合成也有调节作用。抗生素合成中的关键酶的限速作用、一些辅酶及前体的供应对抗生素的合成效率都有很大影响。因此，抗生素的产生受到多层次的调控【王琳淇等.微生物学报.2009；49(4)：411-416】。

在抗生素高产菌遗传育种中，最常用的靶点是途径专一性的调节因子，这些基因位于抗生素生物合成基因簇中，敲除一些负调控因子，或超量表达一些正调控因子都有助于提高抗生素的合成水平。对一些链霉菌中特有的多效调节基因的遗传改造也有助于抗生素高产菌的育种【雷健等.药物生物技术.2007；14(3)：225-229】。

核糖体再循环因子RRF在细胞中参与蛋白质合成过程，是蛋白质合成中不可缺少的成分。在蛋白质合成结束后，RRF会与翻译延伸因子一起把核糖体从mRNA上解离下来，参与下一轮蛋白质合成。从三维结构来看，这个RRF蛋白更像是tRNA的结构类似物，所以有科学家认为核糖体从mRNA上解离过程依赖的是RRF的类tRNA结构。后有研究表明在大肠杆菌中RRF主要与50S核糖体亚基作用，推测它与核糖体结合后占据了乙酰化的tRNA结合位点，导致tRNA从核糖体上解离【Yokoyama T等，EMBO J.2012；31(7)：1836-1846】。

核糖体再循环因子RRF毋庸置疑决定蛋白质的合成水平，所以RRF成为抗生素遗传育种的新型靶点【Li L等，JIndMicrobiol Biotechnol.2010；37(7)：673-679】，因为抗生素生物合成的一些结构酶的表达也依赖于核糖体再循环因子。

芳香聚酮抗生素美达霉素属于苯并异色烷醌(benzoisochromanequinones)家族，可由纳士威尔链霉菌AM-7161(Streptomyces nashivillensis AM-7161)产生，具有抗菌和抗肿瘤的生物学活性，可以以一种新颖的机制阻断多种肿瘤细胞的信号传导，是一种具有开发潜力的抗癌药物【Salaski EJ等，JMed Chem.2009；2(8)：2181-2184】。

为提高野生菌纳士威尔链霉菌AM-7161中美达霉素的生物合成水平，本发明旨在从AM-7161中克隆了核糖体再循环因子，并把它构建成高表达质粒，导入美达霉素产生菌中，有效促进了美达霉素的产量。

发明内容：

本发明目的是从苯并异色烷醌类抗肿瘤抗生素美达霉素的野生型产生菌中克隆核糖体再循环因子RRF的编码基因(frr)，构建这个基因的高效表达质粒，导入美达霉素的产生菌内并实现高效表达，从而促进美达霉素的生物合成。

本发明是这样实现的：对GenBank中来自其它细胞的核糖体再循环因子的编码基因(frr)序列进行比对，根据它们的序列保守性设计简并引物，选择以美达霉素产生菌纳士威尔链霉菌AM-7161的基因组为模板，对核糖体再循环因子基因进行PCR扩增。将PCR产物的测序结果进行同源性比对后，将它克隆到链霉菌高效表达质粒pIJ8600上，获得一个核糖体再循环因子高效表达链霉菌质粒pHSL56.2。然后通过原生质体转化，将pHS56.2导入美达霉素产生菌AM-7161中，构建工程菌AM-7161/pHSL56.2。在工程菌AM-7161/pHSL56.2细胞内核糖体再循环因子的高效表达对美达霉素产生水平起到促进作用。

具体步骤为：