[发明专利]丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种采用实时荧光RT-PCR检测样本中HCV 1b、2a、3a、3b和6a亚型病毒核酸存在的方法及试剂盒。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus，HCV)是引起输血后非甲非乙型肝炎(NANBH)的主要病原体，全球性传染，给人类健康带来极大的危害。HCV传播途径包括：输血及器官移植传播、静脉药瘾传播、医源性传播及性接触传播等。据世界卫生组织(WHO)估计，全世界HCV感染率平均约为3％，即约1.7-2.0亿HCV感染者，而且每年仍有300万～400万新发病例。HCV感染率在不同国家和地区有很大差异。鉴于传染源和传播途径的持续存在，加之近期内还不可能提供安全有效的疫苗，估计到2015年，慢性HCV感染的总人数将会增加4倍。我国HCV感染率也相当高，1992-1995年全国病毒性肝炎血清流行病学调查结果显示我国抗-HCV的阳性率平均为3.2％，略高于全球平均水平，由于人口基数大，即使按照当时的总人口计算，HCV感染的绝对人数也已超过3000万。

丙型肝炎自然病程的发展是一个非常复杂的生物学过程，受病毒和宿主等多种因素的影响，如HCV病毒载量、基因型以及宿主年龄、性别、种族和免疫抑制等。有报道高水平病毒血症和HCV基因1b型感染可能与疾病进展或发展为肝癌有关；此外，年长者感染HCV、男性、酗酒、吸烟、肥胖、脂肪肝以及合并HBV或HIV感染也是加速或促进疾病恶化的相关因素。HCV高度变异性、泛嗜性、免疫耐受、免疫损伤等因素是导致HCV感染慢性化的重要原因，持续慢性HCV感染在临床上可表现为各种不同类型的疾病，从无症状携带者到轻重悬殊、进展速度快慢不一的肝脏炎症和纤维化，有的还可能发展为肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。此外，HCV感染常伴发许多肝外疾病，如冷球蛋白血症、肾小球肾炎、皮肤黏膜病变和自体免疫性疾患等。感染HCV后发展为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌的时间大致为10年、20年和30年左右。据统计，丙型肝炎患者中约有60％转为慢性肝炎，其中又有20％的病人转为肝硬化或肝细胞肝癌(HCC)。全球每年HCV感染的患者数呈上升趋势，而且HCV感染的慢性化发生率明显高于乙型肝炎，易出现肝硬化、肝癌，是重要的死亡原因之一，因此慢性丙型肝炎病毒感染的诊断和治疗日益成为人类亟待解决的公共卫生难题。

HCV分子生物学特征：

丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒，由于基因型不同，从各地分离的HCV基因组长度也不一致，一般为9400左右个核苷酸。基因组5′和3′端分别为非编码区(Untranslated Regeion，UTR)，中央部分为一个大的开放阅读码框架(Open Reading Frame，ORF)。结构区又分为核心蛋白基因区(C区)和衣壳蛋白基因区(E1和E2)；非结构区又分为NS1、NS2、NS3、NS4、NS5等。NS5区又分为两个亚区：NS5a区和NS5b区。各区序列保守程度由高到低依次为：5′UTR区＞C区＞NS3区＞NS4区、NS5区＞NS2区＞NS1/E2、E1＞3′UTR区。

HCV RNA具有高度的变异性，其变异率高达1.4-1.9×10^-3/核苷酸/年。其原因主要有：①复制酶无校正功能：HCV的复制不需逆转录酶的参与，直接在RNA依赖性RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerae，RDRP)指导下进行复制，而RDRP缺乏3′→5′核酸外切酶校正功能及其他核酸复制后修复能力，病毒复制可发生随机突变，复制中的错误掺入无法校正，最终导致HCV的高度变异；②易误性RDRP(error-prone RDRP，EP-RDRP)的存在：在HCV复制过程中存在的EP-RDRP，也是导致高度变异的重要原因；③正选择作用：由于宿主免疫选择压力的作用，使能有效激活宿主免疫应答的基因的变异高于其它基因。

HCV基因分型：