[发明专利]丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测试剂盒及方法

权利要求书

1.丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：RNA提取液，PCR反应液，RT-PCR酶系，阳性质控品，阴性质控品，所述PCR反应液包括：

引物L-pri-C1：5’-ACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAG-3’；

引物L-pri-C2：5’-AATTGCCAGGACGACCGGGTCCTT-3’；

引物L-pri-C3：5’-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’；

探针L-pro-C1：5’-CCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGC-3’；

探针L-pro-C2：5’-GGAATTGCCGGGAAGACTGGGTCCTTTC-3’；

探针L-pro-C3：5’-ACCGGAATCGCTGGGGTGACCGGGTCC-3’；

探针L-pro-C4：5’-AACCCGCTCAATGCCCGGAAATTTGG-3’；

探针L-pro-C5：5’-CCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGT-3’；

所述探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。

2.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针5’端标记FAM或HEX，3’端标记TAMARA或BHQ1。

3.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR酶系包括M-MLV逆转录酶、RNase抑制剂、Taq DNA聚合酶。

4.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括纯水、RT-PCR buffer、MgCl₂、dATP、dTTP、dGTP、dCTP。

5.丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测方法，其特征在于，包括下述具体步骤：

a、提取待测样品的RNA；

b、以步骤a提取的RNA为模板，用权利要求1所述引物和探针采用一步法RT-PCR方法进行PCR荧光检测，根据扩增曲线判定样品检测结果。

6.根据权利要求5所述的丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤a具体为：

1)吸取600μl RNA提取1液转入洁净的1.5ml离心管，再加入100μl待测样品，迅速地振荡混匀，静置5分钟；

2)加入500μl RNA提取2液，迅速地振荡混匀；

3)吸取600μl步骤2)得到的裂解混合液转移至RNA纯化柱的吸附柱中，8000rpm离心1分钟；

4)将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，重复步骤3)；

5)将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，往吸附管中加入500μlRNA提取3液，8000rpm离心1分钟；

6)将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，往吸附管中加入500μlRNA提取4液，8000rpm离心1分钟；

7)将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，往吸附管中加入500μlRNA提取5液，8000rpm离心1分钟；

8)将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，将吸附管装回收集管中，12000rpm离心1分钟，丢弃RNA纯化柱的收集管，将RNA纯化柱的吸附管放入到一洁净的RNA收集管中；

9)往吸附管中央滴加35μl RNA提取6液，静置2分钟后，12000rpm离心2分钟，收集流穿液，-20℃保存备用。