[发明专利]亚克隆细胞株TF-1-A2及其制备方法与用途

权利要求书

1.一种筛选亚克隆细胞株TF-1-A2的方法，包括如下步骤：

4)利用NGF对rhGM-CSF依赖的TF-1细胞株进行驯化，使其转变为依赖NGF维持正常生长TF-1细胞株，

5)对NGF依赖的TF-1细胞株进行克隆化，挑选单克隆细胞扩大培养，

6)绘制各单克隆细胞株对NGF的剂量-效应曲线，根据Emax值和信噪比S/N值对得到的单克隆细胞株进行筛选，获得TF-1-A2亚克隆细胞株。

2.根据权利要求1所述的方法，所述NGF为小鼠NGF。

3.根据权利要求1所述的方法，所述克隆化的方法为半固体培养基克隆化法。

4.根据权利要求4所述的方法，所述半固体培养基为甲基纤维素类培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，所述驯化是在一定浓度的NGF存在下，通过倍比稀释逐步降低GM-CSF浓度并连续传代的方法将GM-CSF依赖的TF-1细胞驯化为NGF依赖的TF-1细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，所述驯化培养基为终浓度为25ng/ml的mNGF的，含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基，调整活细胞浓度按1×10⁵cells/孔接种至培养板，依次向孔板中添加含有按1∶2的比例倍比稀释的浓度梯度的rhGM-CSF的基础培养基，驯化五代即可。

7.根据权利要求1-6任一所述方法得到的亚克隆细胞株TF-1-A2。

8.权利要求7所述的亚克隆细胞株TF-1-A2，其保藏编号为：CGMCC No.5969。

9.权利要求7或8所述的亚克隆细胞株TF-1-A2在体外定量测定NGF生物学活性中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述NGF为小鼠NGF或重组人NGF。

11.根据权利要求9所述的应用，所述定量测定的方法包括如下步骤：A、检测起始孔浓度为200ng/ml，进行4倍系列稀释，共9个稀释度，将标准品溶液转移至培养板的孔板中；B、取对数生长期的mNGF依赖的TF-1-A2细胞，于1000rpm离心10min收集细胞，用RPMI 1640基础培养液洗涤，然后重悬于含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中，调整细胞浓度5×10⁴个细胞/ml的细胞悬液，孔板中每孔加入100μl；C、将细胞培养板于37℃、5％CO₂条件下培养分别培养72h后，每孔加入MTS/PMS溶液20μl，于37℃、5％CO₂条件下继续培养4h，D、取出利用BioTek公司的EPOCH超微量微孔板分光光度计于波长490nm处测定吸光度；E、使用GraphPad Prism5软件分析数据，利用四参数方程绘制剂量-效应反应曲线，通过待测制品的吸光度，计算出待测NGF的生物学活性。