[发明专利]一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

橡胶树(Hevea Brasiliensis Mull.Arg)属于大戟科(Euphorbiaceae)橡胶树属(Hevea)，是多年生异花授粉乔木，栽培于热带地区。由于橡胶树生活周期长，从种子萌发到幼龄橡胶树开割，需要6年以上的时间，因此常规育种周期较长，一般在30年左右。利用转基因技术对巴西橡胶树进行遗传改造，可为橡胶树品种改良创造优良条件，缩短育种周期。目前，已有不少国家投入大量的人力物力进行广泛的研究并取得了一定的进展(Leclercq J，Martin F，Lardet L，et al.Genetic transformation and regeneration of plant over-expressing CuZnSOD geneto control oxidative stress in rubber tree.In：Proceeding of InternationalRubber Conference，Siem Reap，Cambodia，2007；Arokiaraj P，Leelawathy R，Yeang H Y. The supervirulence plasmid pToK47 fromAgrobacterium tumefaciens A281 improves transformation efficiency ofHevea brasiliensis [J].American Journal of Biochemistry andBiotechnology，2009，5(3)：137-141；黄天带，李哲，孙爱花等.根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传体系的建立.作物学报，2010，36(10)：1691-1697)。

目前，巴西橡胶树遗传转化中受体材料主要以致密的花药胚性愈伤组织为主，其转化过程中仍存在很多困难，其主要的是转化效率较低，转基因植株获得率低，以及转化受体材料受花期限制等，无法满足试验和生产需要。为此，人们希望通过建立高效的遗传转化体系，来满足生产和实验的需要。然而，由于多种因素的限制，建立高效遗传转化体系仍面临诸多困难，如何解决这些困难，最终建立起稳定、高效的遗传转化体系成为目前最迫切的任务。

发明内容

本发明的目的是以巴西橡胶树优良品种的花药愈伤组织诱导的胚性细胞悬浮系为受体材料，利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化，经体细胞胚发生途径获得再生转基因植株。

为了实现本发明目的，本发明的一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，包括如下步骤：

1)工程菌液的制备：取-80℃保存的根癌农杆菌菌种在添加有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB(发根农杆菌培养基)固体培养基上划线，28℃倒置培养48～72h，挑取单菌落置于添加有相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃条件下在220rpm(转每分钟)的摇床上振荡培养24～48h至根癌农杆菌处于对数生长期，然后取10～30ml菌液，用无菌的50ml离心管室温条件下4000rpm离心10min收集菌体，收集的菌体用100ml AAM培养基重悬，在相同条件下振荡培养4～6h后用新鲜的AAM培养基稀释至OD600＝0.1～0.6(OD600为液体在600nm波长处的吸光值)作为工程菌液；

2)工程菌侵染悬浮细胞：将橡胶树胚性悬浮细胞去除培养基后放入20～30ml工程菌液中浸泡1～5min，让工程菌侵染橡胶树胚性悬浮细胞；

3)悬浮细胞与工程菌共培养：将侵染后的橡胶树胚性悬浮细胞去除菌液并用无菌滤纸吸干后，接种到共培养基上共培养，培养温度20～25℃，培养2～8d；

4)悬浮细胞的脱菌培养：经共培养的橡胶树胚性悬浮细胞用无菌水充分漂洗3～5次，尽可能去除农杆菌后，接种到脱农杆菌培养基上，25～28℃条件下暗培养15～30d，去除农杆菌并诱导产生胚性愈伤组织；

5)抗性胚性愈伤组织的筛选：将诱导的胚性愈伤组织接到筛选培养基上，25～28℃暗培养，每15～30d转接到新鲜的筛选培养基上，筛选培养2～4次，挑选出抗性愈伤组织单独继续在相同培养基上继代培养；

6)抗性愈伤组织诱导胚状体：将继代培养后的抗性愈伤组织接到体细胞胚诱导培养基上，25～28℃条件下暗培养，每25～30d转接到新鲜的培养基上直至体细胞胚发育成熟。