[发明专利]一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）工程菌侵染悬浮细胞：将橡胶树胚性悬浮细胞去除培养基后放入20～30ml工程菌液中浸泡1～5min，让工程菌侵染橡胶树胚性悬浮细胞；

2）悬浮细胞与工程菌共培养：将侵染后的橡胶树胚性悬浮细胞去除菌液并用无菌滤纸吸干后，接种至共培养基上共培养，培养温度20～25℃，培养2～8d；

所述的共培养基的有效成分为改良的MS培养基(七水硫酸镁300～550mg/L，磷酸二氢钾300～500mg/L，无水氯化钙150～550mg/L，一水硫酸锰15～45mg/L，五水硫酸铜0.1～0.35mg/L)，添加2,4-二氯苯氧乙酸0.1～3.0mg/L，α-萘乙酸0.1～2.0mg/L，激动素0.1～3.0mg/L，肌醇0.1～0.2g/L，椰子水30～50ml/L，蔗糖30～70g/L，乙酰丁香酮50～100μM，植物凝胶2～3g/L；

3）悬浮细胞的脱菌培养：经共培养的橡胶树胚性悬浮细胞用无菌水充分漂洗3～5次后，接种到脱农杆菌培养基上，25～28℃条件下暗培养15～30d，去除农杆菌并诱导产生胚性愈伤组织；

所述的脱农杆菌培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加2,4-二氯苯氧乙酸0.1～3.0mg/L，α-萘乙酸0.1～2.0mg/L，激动素0.1～3.0mg/L，肌醇0.1～0.2g/L，椰子水30～50ml/L，蔗糖30～70g/L，替卡西林200～500mg/L，植物凝胶2～3g/L；

4）抗性胚性愈伤组织的筛选：将诱导的胚性愈伤组织接到筛选培养基上，25～28℃暗培养，每15～30d转接到新鲜的筛选培养基上，筛选培养2～4次，挑选出抗性愈伤组织单独继续在相同培养基上继代培养；

所述的筛选培养基有效成分为改良的MS培养基，添加2,4-二氯苯氧乙酸0.1～3.0mg/L，α-萘乙酸0.1～2.0mg/L，激动素0.1～3.0mg/L，肌醇0.1～0.2g/L，椰子水30～50ml/L，蔗糖30～70g/L，替卡西林200～500mg/L，卡那霉素50～200mg/L，植物凝胶2～3g/L；

5）抗性愈伤组织诱导胚状体：将继代培养后的抗性愈伤组织接到体细胞胚诱导培养基上，25～28℃条件下暗培养，每25～30d转接到新鲜的培养基上直至体细胞胚发育成熟；

所述的体细胞胚诱导培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加激动素1.0～3.0mg/L，α-萘乙酸0.1～0.5mg/L，6-苄氨基腺嘌呤0.1～3.0mg/L，赤霉素 0.1～3.0mg/L，活性炭1～2g/L，肌醇0.1～0.2g/L，椰子水30～50ml/L，蔗糖30～70g/L，植物凝胶2～3g/L；

6）植株再生：将成熟胚状体接种到再生植株培养基，25～28℃条件下光照培养，光周期为16h/d，直至长出完整再生植株；

所述的再生植株培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加激动素0.5～3.0mg/L，α-萘乙酸0.01～1.0mg/L，赤霉素0.1～3.0mg/L，蔗糖50～90g/L，活性碳1～2g/L，椰子水30～50ml/L，植物凝胶2～3g/L。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，其特征在于，工程菌液的制备是取-80℃保存的根癌农杆菌菌种在添加有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB固体培养基上划线，28℃倒置培养48～72h，挑取单菌落置于添加有相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃条件下在220rpm的摇床上振荡培养24～48h至根癌农杆菌处于对数生长期，然后取10～30ml菌液，用无菌的50ml离心管室温条件下4000rpm离心10min收集菌体，收集的菌体用100mlAAM培养基重悬，在相同条件下振荡培养4～6h后用新鲜的AAM培养基稀释至OD600＝0.1～0.6(OD600为液体在600nm波长处的吸光值)作为工程菌液。