[发明专利]一种鉴别鸭瘟病毒强毒与疫苗毒的PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物医学的科研和生产领域，特别涉及基于鸭瘟病毒强毒株与弱毒疫苗株UL2基因差异的PCR检测方法

背景技术

由鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)感染所致的鸭瘟(Duck plague，DP)，又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，是鸭、鹅、天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病，其致病特征是血管损伤、组织出血、消化道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡，在世界各养鸭地区都有分布，其预防和控制已直接关系到水禽养殖业的持续稳定发展。我国鸭瘟的预防主要采用接种弱毒疫苗，而准确的诊断、监测是有效预防和控制该病的基础和前提。目前，报道的DPV的诊断和监测方法有多种，如免疫荧光、聚合酶链式反应(PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)等，但却未见任何方法可将生产养殖中的鸭是因感染强毒鸭瘟病毒还是因已注射鸭瘟疫苗而呈现的阳性区分开。因此若已进行了鸭瘟病毒免疫的某养殖场出现鸭瘟病毒的诊断和监测出现阳性时，现在的检测方法无法判断该鸭场是因感染强毒鸭瘟病毒还是因已注射鸭瘟疫苗而呈现的阳性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可鉴别鸭瘟病毒强毒与疫苗弱毒的PCR检测方法。所用鸭瘟病毒模板是各种疑鸭瘟病毒感染的组织病料或已经在鸭胚成纤维细胞DEF上增殖后细胞病变(CPE)达60％～70％的DEF中提取，同时设立未接毒的DEF或其它相应组织材料的阴性对照。所获得的DNA模板作10倍浓度梯度稀释以检测该方法灵敏性，同时对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、马立克氏病毒(MDV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭肿头败血症病毒(DSHSV)、鹅细小病毒(GPV)、禽流感病毒(AIV)、鸭疫里默氏菌(RA)、鸭沙门氏菌(Sa1.A)、巴氏杆菌(PM)和鸭大肠杆菌(E.coli)DNA进行PCR扩增以检测该方法特异性，并设立空白对照。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种鉴别鸭瘟病毒强毒与疫苗弱毒的PCR检测方法，具体步骤为：

a利用Primer Premier5.0软件，参考强弱毒株UL2基因序列(GenBank登录号：强毒JQ647509，EU885419，JQ043216，JQ 248596，JQ 248597，JQ248598；弱毒JQ347517，JQ347518，EF449516，EU082088)设计引物，由宝生物生物技术有限公司合成。

上游引物P1：5’-ACGAGGGAGACCCAAATGAC-3’

下游引物P2：5’-TTTATACTGTTCCACAAGGAAGTTG-3’

b模板DNA的提取：

(1)材料的预处理：感染DPV的单层细胞(如鸭胚原代成纤维细胞或CCL-141等)，当细胞病变(CPE)达60％～70％时，反复冻融3次，8000r/min 30min，取上清液备用。接种DPV的鸡胚或鸭胚，胚死亡后按常规收取尿囊液，6000r/min 10min，取上清备用。鸭组织样品，取鸭组织器官样品(心、肝、脾、肺、肾、脑、十二指肠、空肠或直肠等)约0.1g，加入灭菌纯水1.0ml，使用匀浆器研磨，反复冻融3次，6000r/min 10min，取上清备用。血液样品：取200ul全血与1.0ml灭菌纯水混合，反复冻融3次，6000r/min 10min，取上清备用。

(2)DNA的提取：①890μl上清液，加入100μl 10％SDS，10μl(10mg/ml)蛋白酶K，混匀；56℃水浴1h，沸水浴10min，室温冷却；②加入400μl Tris饱和酚，混匀，4℃10000r/min 5min；③取上清，加入200μl饱和酚和200μl氯仿/异戊醇(24/1)，混匀，4℃10000r/min 5min；④取上清，加入400μl氯仿/异戊醇(24/1)，混匀，4℃10000r/min5min；⑤取上清，加入1/10体积的3mol/L NaAC，2倍体积的冷无水乙醇，混匀，存放于-20℃至少40min；⑥4℃12000r/min 20min，弃上清；⑦加入200μl 75％冻乙醇洗涤沉淀，4℃12000r/min 20min，弃上清，离心真空干燥，加入20μlTE溶解沉淀，4℃6000r/min 30s。

c PCR扩增DPV UL2基因，同时设立阴性及空白对照，反应体系如下：

轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR。