[发明专利]一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，属于材料、生物、和分析化学交叉学科的技术领域，具体涉及到一种基于超分子组装体在酶催化水解作用下解组装来实现胰蛋白酶检测的方法的技术方案。

背景技术

胰蛋白酶是蛋白质分解中最重要的消化酶之一，胰蛋白酶原的分泌、活化、抑制以及循环的不平衡会导致急性或慢性的胰腺疾病，严重的例如胰腺癌。胰腺癌是恶性度最高、预后最差的一种肿瘤，患者的5年生存率一般不到5%，大约每年有35000例胰腺癌是由于丝氨酸蛋白酶尤其是胰蛋白酶的不平衡引起的。此外胰蛋白酶不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。

目前发展起来的测定胰蛋白酶的方法主要有紫外分光光度法、比色法、荧光法、免疫法、放射性元素标记法、质谱法（MS）、液相色谱法（HPLC）、电泳法等。紫外法和比色法操作简单，但灵敏度低，重现性差。免疫法灵敏度高，如专利201020245770.x所述，但由于单克隆抗体的使用使得成本也高，且需要一定的操作技术。放射性元素标记法需要对底物进行标记，制备复杂并且有一定的安全性问题等等。质谱仪器昂贵，对样品的纯度要求高，色谱以及电泳法需要比较复杂的操作和较长的检测时间。

相比这些方法，荧光法操作简便、灵敏度高、可实现实时监测，具有临床应用的潜在可能。但一般的荧光法需要荧光标记底物，制备复杂且提高了成本，使其应用受到限制，近年来无标记的方法受到关注。目前报道的无标记荧光检测的方法主要是应用水溶性荧光共轭聚合物以及新型的聚集诱导发光分子，这些分子的合成与分离仍然比较复杂。因而建立试剂易得，制备简单的荧光检测方法具有重要的意义。通过检索，未见无标记荧光检测胰蛋白酶的方法。

发明内容

本发明一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法的目的是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、快速、灵敏、无须有机合成的无标记荧光检测胰蛋白酶方法。

本发明一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于是一种基于超分子组装体在酶催化水解作用下解组装来实现胰蛋白酶检测的方法，其具体步骤为：

Ⅰ 配制荧光探针的有机溶液：

以疏水染料为荧光探针，将疏水染料溶解到市售光谱纯丙酮、氯仿或甲醇的有机溶剂中，配制浓度为 10^-3 ~ 10^-6mol L^-1荧光探针的有机溶液；

Ⅱ 测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC：

将表面活性剂溶解于浓度为10 mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中，配制浓度范围为1mol L^-1~10^-7mol L^-1的梯度溶液，用微量进样器移取步骤Ⅰ配制的荧光探针有机溶液，加入到梯度溶液中，使梯度溶液中探针的终浓度为10^-8 ~10^-6 mol L^-1，以40~100kHz敞口超声波处理10~60分钟，静置0.5~12小时后进行荧光光谱检测，测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC；

Ⅲ 配制超分子组装体溶液：

根据步骤Ⅱ得到的表面活性剂的临界胶束浓度CMC，确定表面活性剂浓度为0.1~1.6CMC，将带相反电荷的聚电解质溶解于浓度为10 mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中制成聚电解质溶液；按照聚电解质与表面活性剂电荷比为1:1，在表面活性剂的溶液中加入等体积的聚电解质溶液，表面活性剂与带相反电荷的聚电解质通过疏水与静电作用形成超分子组装体，混合均匀，静置10~15分钟，得到超分子组装体溶液，该超分子组装体溶液的重量百分浓度为0.01~0.2%；

Ⅳ 配制检测液：

再次用微量进样器移取步骤Ⅰ配制的荧光探针有机溶液，分别加入到Ⅲ所得到的超分子组装体溶液中，使该超分子组装体溶液中探针的终浓度为10^-8~10^-6mol L^-1，以40~100kHz敞口超声波处理10~60分钟，静置0.5~12小时后得到检测液；

Ⅴ 测定催化水解时间：