[发明专利]一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于是一种基于超分子组装体在酶催化水解作用下解组装来实现胰蛋白酶检测的方法，其具体步骤为：

Ⅰ 配制荧光探针的有机溶液：

以疏水染料为荧光探针，将疏水染料溶解到市售光谱纯丙酮、氯仿或甲醇的有机溶剂中，配制浓度为 10^-3 ~ 10^-6mol L^-1荧光探针的有机溶液；

Ⅱ 测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC：

将表面活性剂溶解于浓度为10 mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中，配制浓度范围为1mol L^-1~10^-7mol L^-1的梯度溶液，用微量进样器移取步骤Ⅰ配制的荧光探针有机溶液，加入到梯度溶液中，使梯度溶液中探针的终浓度为10^-8 ~10^-6 mol L^-1，以40~100kHz敞口超声波处理10~60分钟，静置0.5~12小时后进行荧光光谱检测，测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC；

Ⅲ 配制超分子组装体溶液：

根据步骤Ⅱ得到的表面活性剂的临界胶束浓度CMC，确定表面活性剂浓度为0.1~1.6CMC，将带相反电荷的聚电解质溶解于浓度为10 mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中制成聚电解质溶液；按照聚电解质与表面活性剂电荷比为1:1，在表面活性剂的溶液中加入等体积的聚电解质溶液，表面活性剂与带相反电荷的聚电解质通过疏水与静电作用形成超分子组装体，混合均匀，静置10~15分钟，得到超分子组装体溶液，该超分子组装体溶液的重量百分浓度为0.01~0.2%；

Ⅳ 配制检测液：

再次用微量进样器移取步骤Ⅰ配制的荧光探针有机溶液，分别加入到Ⅲ所得到的超分子组装体溶液中，使该超分子组装体溶液中探针的终浓度为10^-8~10^-6mol L^-1，以40~100kHz敞口超声波处理10~60分钟，静置0.5~12小时后得到检测液；

Ⅴ 测定催化水解时间：

步骤Ⅳ得到的检测液在35~37℃下培养10~15分钟，将胰蛋白酶溶解于浓度为10 mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中，在检测液中分别加入相同体积的胰蛋白酶缓冲溶液，以只加入缓冲溶液作为空白对照，胰蛋白酶终浓度范围为0.01~100 μg mL^-1，在35~37℃下进行荧光光谱跟踪检测，以荧光发射峰强度下降的比率对时间作图，得到不同浓度胰蛋白酶催化水解条件下荧光发射峰强度线性下降的时间范围；

Ⅵ 测定胰蛋白酶活性：

根据步骤Ⅴ得到的时间范围，取各浓度条件下共同线性时间范围的最大值，以荧光发射峰强度下降的比率对加入胰蛋白酶浓度作图，得到检测标准曲线。

2.按照权利要求1所述一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的疏水染料为市售纯度高于98%的芘、尼罗红、香豆素481、苏丹红或氟硼荧染料BODIPY，氟硼荧染料BODIPY是指BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 581/591、BODIPY TR或BODIPY 630/650。

3.按照权利要求1所述一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的表面活性剂为带负电荷的烷基硫酸盐或烷基磺酸盐，烷基硫酸盐为市售分析纯十二烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；烷基磺酸盐为市售分析纯十二烷基磺酸钠、十四烷基磺酸钠或十六烷基磺酸钠。

4.按照权利要求1所述一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的聚电解质是可以被胰蛋白酶催化水解的多肽，多肽为市售纯度高于99%的，长度为10~16的带正电荷的精氨酸序列Arg₁₀ ~ Arg₁₆。