[发明专利]幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质组学领域，尤其是一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)在1983年由澳大利亚医生发现，呈螺旋状，为革兰氏阴性菌，定殖于人胃部。幽门螺旋杆菌感染是引起人类消化道疾病的重要原因，能够导致慢性胃炎、严重萎缩性胃炎、消化道溃疡和胃癌等相关疾病。

幽门螺旋杆菌存在多种毒力因子，包括鞭毛蛋白(flagellin)、空泡毒素(vacuolating cytotoxin，VacA)、细胞毒素相关蛋白(cytotoxin associated gene A，CagA)和尿素酶(urease)等。鞭毛蛋白是幽门螺旋杆菌鞭毛的主要组成蛋白，是细菌运动的动力，鞭毛蛋白本身可以抵御酸性环境，对鞭毛具有保护作用，运动能力较强的菌株其致病性较高。空泡毒素VacA能够分泌到细菌外部，对胃上皮细胞造成损伤，产生空泡性病变，另外能够改变细胞膜的离子通透性，导致细胞整体病变。所有幽门螺旋杆菌存在VacA编码基因，但是只有约50％的菌株表达VacA蛋白。细胞毒素相关蛋白(CagA)分子量为128kD，存在于60-70％的幽门螺旋杆菌菌株中，具有CagA为I型菌株，具有较强致病性，CagA阴性为II型菌株，致病性较弱，在胃炎患者中中，CagA抗体阳性率为70-75％，在十二指肠溃疡患者中，CagA抗体阳性率几乎为100％。尿素酶产生高浓度氨，导致细胞空泡病变。

西方国家30-50％的人群感染过幽门螺旋杆菌，我国幽门螺旋杆菌感染率高达70-90％，随着年龄增长，感染率有增加的趋势。感染人群中的10％的患者会出现临床症状，包括胃炎、胃十二指肠溃疡等，若不接受抗菌素治疗，感染可持续终生，其中部分患者可能导致胃癌。

目前检测幽门螺旋杆菌感染的方法较多，包括检测患者血清中的幽门螺旋杆菌抗体、粪便中幽门螺旋杆菌的抗原、尿素呼气试验、定量PCR方法、细菌培养方法和病理学检测方法等。其中，检测患者血清中的幽门螺旋杆菌抗体，包括酶联免疫吸附试验、免疫印记和胶体金等方法，具有特异性高，能够定量分析的特点，但是试验中涉及的幽门螺杆菌抗原，为部分纯化的幽门螺旋杆菌全抗原，其特异性和稳定性等方面不能完全满足检测要求。

发明内容

本发明在于在于克服现有技术的不足之处，提供一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，本蛋白组可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，步骤如下：

(1)分别扩增6种毒力蛋白基因，针对6种毒力蛋白设计引物，引物序列见序列1至序列12，引物分别插入限制性内切酶位点；

(2)分别克隆6种毒力蛋白编码基因；

(3)分别亚克隆6种毒力蛋白编码基因到表达载体上；

(4)大肠杆菌宿主细胞内分别表达6种毒力蛋白；

(5)纯化；

所述6种毒力蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。

而且，所述步骤(2)的6种毒力蛋白编码基因分别克隆到TOPO TAKits试剂盒或T-EASAY试剂盒的质粒载体上。

而且，所述步骤(3)的6种毒力蛋白编码基因分别亚克隆到表达载体pQE30上。

而且，所述步骤(5)利用Ni-NTA纯化填料制备的层析柱，分离纯化这6种重组毒力蛋白。

本发明的有益效果和优点是：

本发明涉及的6种毒力蛋白包括细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B，其编码基因或氨基酸序列具有高度保守性和特异性，并且与患者的症状相关，因此制备的毒力蛋白可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原，以及临床用药指导以及流行病学调查等多个领域。

附图说明

图1为本发明幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的PCR扩增产物分析，其中，1cagA，2vacA，3ureA，4ureB，5flaA，6flaB；