[发明专利]春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明属植物组织培养技术领域，具体涉及一种春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法。

背景技术

石斛兰(Dendrobium)是兰科石斛兰属多年生花卉，石斛兰属是兰科植物中最大的一个属，原产地主要分布在亚洲热带和亚热带，澳大利亚和太平洋岛屿，全世界约有1000多种，我国有约76种，其中大部分分布于西南、华南、台湾等地。

在园艺学上石斛兰的品种一般以其开花期来划分春石斛系和秋石斛系两大类，春石斛兰(Dendrobium nobile)属落叶温带种，其花色鲜艳，豪华灿烂，常作为盆花栽种；秋石斛则为流行的切花。石斛兰花色繁多，有玫红、粉红、黄色、白色等，艳丽多彩，是珍贵的观赏名花，其中一些种类还具有药用价值。

近年来，春石斛兰在东南亚一带非常受欢迎，其需求量增长甚快。目前我国主要依靠从日本等国进口种苗，有关科学家开展了春石斛兰的组织培养研究。毛碧增等较早开展了春石斛的组织培养技术研究，研究了不同灭菌方式对成活率的影响，BA与NAA不同浓度组合对诱导不定芽及不定芽增殖的影响，GA₃和亚精胺对壮苗的作用。结果表明：0.1％HgCl₂6min组合嫩茎成活率最高，0.1％HgCl₂8min老茎成活率最高，0.5mg/L NAA和1.0mg/L BA组合最利于诱导不定芽，GA₃和亚精胺对不定芽的增殖和生长有促进作用【毛碧增等，春石斛组织培养技术研究，浙江大学学报(理学版)，2003，30(5)：580-583】。

韩磊等报道了不同激素对春石斛的组织培养影响研究，用1～3mm的春石斛茎尖为外植体，以1/2MS为基本培养基，调节不同激素水平诱导芽体萌发，进行繁殖培养。研究结果表明：萌芽诱导阶段：1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+椰子汁200mL/L+蔗糖30g/L+活性碳3g/L+琼脂5g/L中萌芽早，生长快；继代和增殖培养阶段：以1/2MS+6-BA 0.5mg/L+NAA2.0mg/L+椰子汁200mL/L+蔗糖15g/L+活性碳3g/L+琼脂5g/L效果最好；生根阶段培养基：1/2MS+NAA 0.1mg/L+蔗糖15g/L+活性碳3g/L+琼脂5g/L，每茎段可生根4条肉质健壮，在培养过程中达到了较好的效果【韩磊等，不同激素对春石斛的组织培养影响研究初报，北方园艺，2007(3)：177～178】。

张爱香等报道了通过拟原球茎发生途径建立春石斛兰的组织培养体系【张爱香等，通过拟原球茎发生途径建立春石斛兰的组织培养体系，北方园艺2009(7)：120～122】。

但是，由于外植体易污染，操作技术要求高、繁殖率低、成本高；春石斛品种间差异大等原因，至今未见利用组织培养技术进行规模化生产春石斛兰种苗的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法。以春石斛兰八分熟蒴果的种子为外植体，采用培养基诱导生成原球茎进行离体快速繁殖，试管苗成活率达100％。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。

所述的春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)外植体的准备和消毒：将春石斛兰人工授粉后进行套袋，约90～110天待其八分成熟后，摘取其蒴果，在超净工作台上，将蒴果表面用75％(体积比)酒精消毒30～60s后，再依次用15～20％(体积比)次氯酸钠溶液浸泡15-20min后无菌水冲洗。

2)原球茎的诱导培养：用无菌吸水纸吸干消毒后春石斛兰蒴果表面水分，用解剖刀切开蒴果，挑取石斛兰种子，接种于诱导培养基上进行暗培养。20～30d后，春石斛兰种子开始萌动，将培养物转移至光照下继续培养40-50d后逐渐萌发成圆锥状的原球茎。其中所述的诱导培养基配方为：MS+BA0.2～2.0mg/L+NAA 0.05～0.5mg/L+水解酪蛋白0.5～1.5g/L+香蕉泥20～80g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.4～5.6。

3)原球茎的增殖与分化：将上述培养获得的原球茎转接于增殖与分化培养基中，培养、萌发、分化成大量不定芽。其中所述的增殖与分化培养基配方为：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+KT 0.2～0.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+水解酪蛋白0.5～1.5g/L+香蕉泥20～80g/L+蔗糖30～40g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.4～5.6。