[发明专利]文蛤微卫星标记的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及文蛤DNA分子遗传标记技术，涉及一种文蛤微卫星标记的检测方法。

背景技术

文蛤是广盐性贝类，分布于中国、朝鲜、日本等亚洲国家。文蛤具有极高的营养价值和经济价值，已成为我国大量出口的重要鲜活水产品之一。由于文蛤养殖具有投资小、见效快、效益高等优点，得到了很大发展。为合理利用和保护文蛤野生种质资源，一些学者利用同工酶技术、RAPD技术以及AFLP技术研究了文蛤的遗传结构及其遗传多样性(林志华等，《大连水产学院学报》，2009，第6期，525-530页；沈怀舜等，《海洋学报》，2003，第25期，97-102页；赫崇波等，《中国水产科学》，第2期，215-221页)。

然而由于同工酶标记、RAPD标记和AFLP标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低，RAPD标记的稳定性不好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随即分布于基因组中，而且微卫星标记检测效率高，结果稳定。目前，文蛤微卫星标记开发滞后，标记数量不足，限制了该物种分子遗传学研究的发展。所以，迫切需要获取微卫星标记以进行文蛤遗传多样性和系谱认证等方面的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种文蛤微卫星标记的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

文蛤微卫星标记的检测方法：首先利用文蛤EST序列获取微卫星标记的微卫星核心序列，并在其序列两端设计特异性引物并进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而检测文蛤个体的基因型，及在此微卫星位点的遗传变异，获得文蛤该位点的遗传多态性图谱；

所述特异性引物为正链：5’-TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3’，负链：5’-AGCATTCACGACACCAACAT-3’。

所述使用微卫星核心序列两端设计的特异性引物序列时的退火温度为58℃。

所述PCR扩增参数为：100ng待测不同地理群体或群体内文蛤个体的基因组DNA，10×PCR Buffer，2.5μL；Mg²⁺，1.5mmol/L；rTaq(5U/μL)，0.2μL；dNTP(10mmol/L)，0.5μL；上述正反向引物(10μmol/L)，各0.5μL；加双蒸水补体系到25μL。

所述PCR扩增为：94℃预变性5min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。所述PCR扩增为：94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸50s。

所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，将PCR扩增反应产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，在凝胶成像系统下观察，如果某一微卫星位点在不同个体中可以扩增出大小不同的片段，即认为这个位点是多态性位点，因此在不同个体间获得的多态性等位基因，就是本位点的遗传变异图谱。

本发明所具有的优点，本发明可快捷的获得微卫星标记的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其他分子遗传标记技术而言，微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出文蛤每个个体的基因型；而应用于不同地理群体或文蛤群体内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。

附图说明

图1是本发明实施例提供的获得微卫星标记MM33945对文蛤30个个体的检测图谱(编号1-30是文蛤的30个个体)。

具体实施方式

下面通过实施例详细叙述本发明。

首先提取文蛤新鲜组织中的基因组DNA并稀释备用；再利用文蛤EST序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对文蛤不同地理或文蛤群体内个体的基因组DNA进行PCR检测，对PCR产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定每个个体的基因型，即获得文蛤的遗传多态性图谱。

实施例1