[发明专利]利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备三氯蔗糖关键中间体蔗糖-6-乙酯的方法，尤其涉及一种利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法。

背景技术

三氯蔗糖(Sucralose) , 是蔗糖的氯化衍生物，是迄今为止人类开发的最完美、最具竞争力、性能稳定、甜感好、安全性高的一种高强度非营养型甜味剂。 

目前，三氯蔗糖的合成方法不外乎化学法和酶法两大类。就化学法来说，传统的全基团保护法缺点在于合成路线冗长，工艺流程复杂，导致产品成本较高。之后公开的单基团保护法明显缩短了合成路线，但对反应条件和分离设备提出了更高的要求。因此在化学法的基础上，又发展了合成三氯蔗糖的生物酶法。

早在1958年，Duff R.B.等［见Biochem. Journal （生物化学杂志）1958年70卷520-528页］就发现巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NCIB 8508 可利用葡萄糖为原料合成葡萄糖-6-乙酯（glucose-6-acetate，缩写为g-6-a）。之后USP 4617269和Jones D.等［见Biotechnology and Bioengineering（生物技术与生物工程）1992年39卷第 2期203-210页 ］用生物法合成了三氯蔗糖，首先利用葡萄糖为原料，通过巨大芽胞杆菌的发酵作用合成葡萄糖-6-乙酯 ，随后在枯草杆菌Bacillus subtilis NCIB 11871分泌的特异果糖基转移酶催化作用下，转移蔗糖分子中的果糖基至g-6-a上生成蔗糖-6-乙酯（sucrose-6-acetate，缩写为s-6-a）。s-6-a再经传统的氯化、醇解就可获得三氯蔗糖。由于氯化、醇解工艺已经十分成熟，没有技术障碍，因此，合成三氯蔗糖的关键中间体是蔗糖-6-乙酯(s-6-a)，它的制备是合成三氯蔗糖的重要瓶颈。

酶法合成s-6-a的最大优点在于其高效专一性，可以省去大量有机溶剂，省去化学法的复杂工艺，是化学法不可比拟的，它具有广阔的应用前景。但现有的技术存在四个缺陷：一、产g-6-a的菌株对发酵合成g-6-a的效率太低（最高产量只有15g/L发酵液）。二、产果糖转移酶的枯草杆菌Bacillus subtilis NCIB 11871还处于专利保护期，不能随意用于商业化生产。三、利用枯草杆菌NCIB 11871产生的果糖转移酶是游离酶，只能一次性使用，利用率低；而且该酶将g-6-a转化为s-6-a时，由于受副产物葡萄糖的抑制，得率只有50％左右。四、s-6-a产品的分离纯化采用制备型高效液相色谱法，其设备投资和运行成本太高，无法应用于生产实际。

鉴于现有技术的上述缺陷，有必要提供一种加以改进的制备蔗糖-6-乙酯的生物学方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯（s-6-a）的方法。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：

本发明的利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法工艺步骤为：

⑴  对巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium NCIM 2087发酵葡萄糖的发酵培养基加以改进，增加培养基中葡萄糖的含量，并添加了乙酸钠和氯化钴成分；

⑵ 对枯草杆菌Bacillus subtilis CGMCC 1.1467进行诱导培养，提取特异性果糖基转移酶EC 2.4.1.162，制成固定化果糖基转移酶；

⑶ 将炭黑曲霉Aspergillus carbonarius CGMCC 3.879制成固定化增殖细胞；

⑷ 将炭黑曲霉制成的固定化增殖细胞和枯草杆菌产出的固定化果糖基转移酶一起，以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖为底物，将葡萄糖-6-乙酯转化为蔗糖-6-乙酯；

⑸ 最后用DTF-01色谱分离、用树脂柱纯化蔗糖-6-乙酯，可以获得85%纯度产品。

步骤⑴所述的巨大芽胞杆菌发酵葡萄糖的发酵培养基的质量百分比组成为：葡萄糖4.0%~10.0%，酵母粉0.1%~0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.05%，七水硫酸镁 0.05%，磷酸氢二铵 0.1% ，氯化钾0.02% ，七水硫酸亚铁0.002%，三水乙酸钠0.001%~0.002%，六水氯化钴0.001%~0.002%，碳酸钙0.5%。