[发明专利]利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法

权利要求书

1.一种利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是工艺步骤为：

(1)对巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium NCIM 2087发酵葡萄糖的发酵培养基加以改进，增加培养基中葡萄糖的含量，并添加乙酸钠和氯化钴等成分；

(2)对枯草杆菌Bacillus subtilis CGMCC 1.1467进行诱导培养，提取特异性果糖基转移酶EC 2.4.1.162，并制成固定化果糖基转移酶；

(3)将炭黑曲霉Aspergillus carbonarius CGMCC 3.879制成固定化增殖细胞；

(4)将炭黑曲霉制成的固定化增殖细胞和枯草杆菌产出的固定化果糖基转移酶一起，以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖为底物，将葡萄糖-6-乙酯转化为蔗糖-6-乙酯；

(5)最后用DTF-01色谱分离、用树脂柱纯化蔗糖-6-乙酯，可以获得85％纯度产品。

2.如权利要求1所述的利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是步骤(1)所述的巨大芽胞杆菌发酵葡萄糖的发酵培养基的质量百分比组成为：葡萄糖4.0％～10.0％，酵母粉0.1％～0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.05％，七水硫酸镁0.05％，磷酸氢二铵0.1％，氯化钾0.02％，七水硫酸亚铁0.002％，三水乙酸钠0.001％～0.002％，六水氯化钴0.001％～0.002％，碳酸钙0.5％。

3.如权利要求1所述的利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是步骤(2)所述的对枯草杆菌进行诱导培养的培养基中含有质量百分比组成为：蔗糖4.0％～10.0％、酵母粉0.3％～0.5％、氯化钾0.05％～0.1％和六水氯化钴0.001％～0.003％，于30～32℃、摇床转速170～190r/min和pH为6.5～7.0的培养条件下培养26～35h获得菌体，按常规方法提取特异性果糖基转移酶，再以壳聚糖凝胶为载体，以戊二醛为交联剂，按常规化学交联法制成固定化果糖基转移酶。

4.如权利要求1所述的利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是步骤(3)所述的将炭黑曲霉制成固定化增殖细胞，是该菌株按CGMCC推荐的培养基和培养条件培养而获得菌体后，取25～28g湿菌体与50mL去离子水配制成菌体悬浮液，加入阳离子聚丙烯酰胺PAM质量百分比为0.2％～0.4％水溶液200ml，搅拌2～3min，再加入质量百分比为3％～3.5％海藻酸钠水溶液200ml，用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用多头造粒器向搅拌下的浓度为0.1～0.2mol/L的无菌CaCl₂溶液滴注，冰箱4℃下固化24h，制得直径2.5～3.5mm的珠型固定化细胞，然后用去离子水洗3～5遍；在无菌条件下移入含有250ml培养基的500ml三角瓶中培养30～32h，使菌株进一步增殖，制成固定化增殖细胞。

5.如权利要求1所述的利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是步骤(4)所述的将炭黑曲霉的固定化增殖细胞和固定化果糖基转移酶一起，以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖为底物，将葡萄糖-6-乙酯转化为蔗糖-6-乙酯，是在500ml三角瓶中，加入pH＝6.0～6.5的磷酸盐缓冲液200ml，加入蔗糖20克和葡萄糖-6-乙酯10克，在180～200r/min摇床转速下升温至30～32℃；然后加入128～150单位u的固定化果糖基转移酶，同时按质量比为1∶20的配比加入固定化增殖细胞，以及1.5～2克食品级碳酸钙粉末；在30～32℃下反应，于10～30h时间段内每隔一定时间取出反应液50μl，离心取上清液按第一步的HPLC色谱法检测底物和产物的含量；当蔗糖-6-乙酯的含量达到最高值后，停止反应，过滤，滤液旋转减压蒸发，真空干燥得到蔗糖-6-乙酯粗品。

6.如权利要求1所述的利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是步骤(5)所述的用DTF-01色谱分离用树脂柱纯化蔗糖-6-乙酯，以树脂为填料，该树脂用无盐水溶胀后，用1～1.5mol/L的盐酸浸泡2h，水洗至中性；再用1～1.5mol/L的NaOH浸泡2h，水洗至中性；再用1～1.5mol/L的CaCl₂浸泡2h，水洗至中性；将水除去，用丙酮浸泡2h，将丙酮除去；用70％丙酮水溶液平衡，得到处理好的色谱分离树脂；色谱柱的径高比为1∶33～1∶38，湿法装柱，用70％丙酮水溶液为洗脱液；蔗糖-6-乙酯粗品用少量洗脱液溶解后上柱，加样量为5.0～6.0g，洗脱速度为1.0ml/min～1.5ml/min，洗脱液用分流器按30∶1分流，其中30份用自动部分收集仪收集，1份连接HPLC跟踪测定流出液的ELSD信号，并记录对应的流出液体积(ml)；收集HPLC跟踪显示含蔗糖-6-乙酯的流出液部分，旋转减压蒸去溶剂，真空干燥得到蔗糖-6-乙酯产品，纯度达到85％以上。