[发明专利]一种检测肺炎支原体的LAMP试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种检测肺炎支原体的环介导等温扩增技术(LAMP)试剂盒。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是引起人类呼吸道感染的重要病原菌，约10％～40％的社区获得性肺炎(CAP)是由Mp感染引起的。婴幼儿由于免疫功能相对低下，更容易引起重症Mp感染，甚至引起肺炎支原体脑炎等严重感染。近几年国内报道的Mp感染引起的肺炎发病率比重不断升高，给社会造成的疾病负担日趋明显。鉴于肺炎支原体分离培养困难，目前其检测方法主要依靠血清学检测和核酸检测。由于血清学技术主要针对抗体进行检测，有明显的滞后性，且受个体免疫差异影响大，所以检测灵敏度和特异度较差。

随着分子生物学的发展，目前已有多种PCR方法用于肺炎支原体的检测，包括：普通PCR，巢式PCR，荧光PCR等，这些虽在灵敏度方面有所改进，但由于核酸检测需要较严格的检测环境，需要精密仪器的配套使用，检测费用较高，同样也无法满足基层和现场检测的需求。

环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isotherm amplification，LAMP)是由Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和两对特殊的引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人(2004)根据LAMP的原理设计了实时定量LAMP方法，以快速检测SARS-CoV，结果LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(2007)建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的LAMP检测体系。

LAMP还可以检测细菌、真菌等病原微生物，其灵敏度和特异性都有很好的体验。但目前尚未见基于颜色判定的LAMP方法在肺炎支原体检测中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测肺炎支原体的特异性LAMP引物组。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作简单的LAMP检测试剂盒。

本发明提供了一种用于检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的靶序列，其具有SEQ ID NO.5所示的序列或其特异性片段。

本发明提供了用于扩增SEQ ID NO.5所示靶序列的特异性引物组合。

本发明提供了一种用于检测肺炎支原体的特异性LAMP引物组合，包括以下4条引物：

F3：5’-TCTTACCACTGTTAACGGCC-3’；

B3：5’-CCGCTTTGGTCAACACATCA-3’；

FIP：5’-ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3’；

BIP：5’-AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3’。

本发明提供了上述引物组在制备肺炎支原体的检测试剂盒或检测试剂中的应用。

本发明提供了一种含有上述4条引物的检测试剂。

本发明提供了一种含有上述4条引物的肺炎支原体的LAMP检测试剂盒。

本发明的试剂盒还包含变色指示剂羟基萘酚蓝(HNB)。

本发明还提供了上述试剂盒在检测肺炎支原体中的应用。

上述试剂盒在检测肺炎支原体中的应用中，25μL LAMP检测体系的具体配置为：10mM dNTP混合溶液2.5μl，3mM羟基萘酚蓝1μl，4M甜菜碱1μl，8U/μl Bst酶1μl，10×Bst buffer2.5μl，10μM F3引物0.5μl，10μM B3引物0.5μl，100μM FIP引物0.4μl，100μM BIP引物0.4μl，150mM硫酸镁1μl，去核酸水13.2μl，模板1μl。

进一步地，检测反应条件为：63℃恒温1h，85℃3min，然后终止反应。

本发明试剂盒还包含阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为去核酸水，所述阳性对照为肺炎支原体基因组DNA。每次检测标本时必须设立NEG对照(阴性对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：

有效扩增：NEG(-)和POS(+)

无效扩增：NEG(+)和POS(+)提示体系污染