[发明专利]一种玉米遗传转化的方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，涉及一种农杆菌介导转化玉米的方法，尤其涉及一种玉米种子整体侵染的方法。

背景技术

玉米是世界主要粮食作物和重要工业原料之一, 在世界农业生产上有着举足轻重的地位。我国为世界第二大玉米生产国，对玉米的需求与日俱增。常规育种技术已无法满足社会对玉米新品种的迫切需求, 而基因工程的应用必将大大推进高产、优质、高抗新品种的选育进程，因此玉米的遗传转化研究具有明显的应用和理论意义。已经应用的遗传转化技术有基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法、PEG介导法、子房注射法、超声波法、阳离子转化法、电击法等。其中玉米遗传转化主流方法是基因枪轰击法和农杆菌介导法。基因枪轰击法有整合模式相对复杂、外源基因表达传代相对不稳定、容易受技术限制的缺点。农杆菌介导法尽管有载体骨架甚至染色体片段可被转移的缺点，但有整合模式相对简单外源基因表达传代相对稳定，操作简便、成本低，也可转移大片段等优点。因此，农杆菌介导的转基因法是目前玉米遗传转化的主流方法之一。

在农杆菌介导的玉米遗传转化中，建立良好的受体系统是玉米遗传转化的重要环节,涉及提供适宜转化的受体材料和转基因后的细胞能否再生植株等问题。常用的受体材料包括: 外植体( 幼胚、幼胚盾片、茎尖分生组织、茎节、幼雄穗、发芽玉米种子、芽尖、胚芽鞘、花粉、小孢子胚等) 、胚性愈伤组织、由胚性愈伤组织建立的悬浮细胞系和由胚性愈伤组织或悬浮细胞系分离出的原生质体。大量研究表明，基因型是外植体形成的愈伤组织重要限制因素，受基因型限制很大，且存在着再生频率低、再生细胞部位与感受态细胞不一致,对农杆菌侵染不敏感且实验周期长、工作量大、培养困难等。而玉米种子不经过愈伤组织培养及再生阶段，侵染后直接发育成植株，不受这些限制。

学术界普遍认为单子叶植物能否利用农杆菌转化的关键因素是农杆菌能否吸附在植物细胞表面，以及外源基因是否能够整合到植物基因组中。早期研究认为, 单子叶植物尤其是禾本科作物不是农杆菌的天然宿主,细胞缺乏农杆菌的附着位点,不能被吸附。许东辉等还从水稻中分离出一种高效抑制农杆菌生长及抑制其在水稻细胞表面附着的信号分子。Roberta等( 1995) 发现玉米等单子叶植物完全能够被农杆菌吸附, 而且在转化过程中加入外源酚类物质通常会提高转化频率。因此，农杆菌能否吸附在植物细胞表面是农杆菌转化的关键限制因素之一。Schlappi 等( 1992) 用带有玉米条斑病毒基因感染玉米幼胚和胚芽鞘, 通过农杆菌对玉米幼胚亲和性的研究, 证明只有那些再生和整合能力强的感受态细胞或处于分裂时期的细胞才能整合外源DNA，得到转化植株, 但大多数基因型玉米缺乏感受态的细胞。而玉米种子是具有潜在分生能力的组织或细胞，在其吸胀阶段用含有目标基因的菌液浸泡，使其在吸胀阶段将含有目标基因的菌液吸进去，在吸胀后，种子萌发，这个时期，种子中的细胞处于分裂时期，且此时细胞表面吸附有农杆菌，从而将外源基因整合到玉米基因组中。目前，这方面的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有玉米遗传转化受体系统取材受限、工作量与难度大、再生困难、转化周期长、效率低及如何在细胞分裂时期保证细胞表面吸附有含有目标基因的农杆菌的难点，提供一种玉米种子整体侵染的方法，以提高玉米的转化效率。

本发明的目的是按以下技术方案实现的：

一种玉米遗传转化的方法，该方法是采用玉米种子整体侵染的方法实现的，步骤包括：①、测成熟玉米种子的生理吸胀曲线，②、目标发根农杆菌的培养，③、玉米种子灭菌，④、结合玉米种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的玉米种子转入到OD₆₀₀值为0.2-0.5左右的发根农杆菌的菌液中振荡侵染18-21小时，⑤、在25℃黑暗条件下共培养3天，⑥、 移栽侵染植株，⑦、转基因植株分子检测；其中：

 步骤①所述测成熟玉米种子的生理吸胀曲线的方法是：取12份等量的成熟玉米种子，每隔3小时取1份浸泡到水中，分别浸泡0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33小时，记录玉米种子不发生损伤的吸胀停滞点为18-24小时；