[发明专利]一种玉米遗传转化的方法

权利要求书

1.一种玉米遗传转化的方法，其特征在于：该方法采用玉米种子整体侵染的方法实现，步骤包括：①测成熟玉米种子的生理吸胀曲线，②目标发根农杆菌的培养，③玉米种子灭菌，④结合玉米种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的玉米种子转入到OD₆₀₀值为0.2-0.5发根农杆菌的菌液中振荡侵染18-21小时，⑤在25℃黑暗条件下共培养3天，⑥移栽侵染植株，⑦转基因植株分子检测。

2.根据权利要求1所述的一种玉米遗传转化的方法，其特征在于：

步骤 ①所述测成熟玉米种子的生理吸胀曲线的方法是：取12份等量的成熟玉米种子，每隔3小时取1份浸泡到水中，分别浸泡0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33小时，记录玉米种子不发生损伤的吸胀停滞点为18-24小时；

步骤 ② 所述目标发根农杆菌培养的方法是：将发根农杆菌在LB固体培养基平板上接种活化二次，之后挑取单菌落接种到5 ml 含有 20 ug·ml^-1利福平和50 ug·ml^-1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5-8小时，然后取1 ml 转接于40 ml 含有20 ug·ml^-1 利福平、50 ug·ml^-1卡那霉素和200 umol·L^-1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养12-16小时后；用含20 ug·ml^-1 利福平、50 ug·ml^-1卡那霉素和 200 umol·L^-1乙酰丁香酮的LB液体培养基稀释上述菌液至OD₆₀₀=0.2-0.5备用；

步骤④所述结合玉米种子的生理吸胀曲线，侵染玉米种子18-21小时的方法是：结合玉米种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟玉米种子转入到装有步骤②制备好的发根农杆菌菌液的无菌器皿中，农杆菌菌液量以刚浸没玉米种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，在温度26^oC、振荡转速166 rpm条件下，培养18-21小时；

步骤 ⑤ 所述的共培养的方法是：待步骤 ④侵染18-21小时后，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3遍后，置于共培养培养基上，25℃黑暗条件下，共培养3天；

步骤 ⑥所述移栽侵染植株的方法是：当步骤 ⑤获得的种子萌发的苗长达到1-2 cm时，用镊子将种子夹出，用含150 mg·L^-1头孢霉素的溶液浸泡1-2分钟后，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内用含150 mg·L^-1头孢霉素的溶液浇水，保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入大花盆中，在温室中培养。