[发明专利]一种番茄遗传转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导转化番茄的方法，属于遗传工程技术领域，具体涉及番茄种子整体侵染转化的方法。

背景技术

番茄是一种世界性种植的最重要的鲜食和加工原料。它的基因组较小，是一种理想的模式植物。另外，番茄还具有自花授粉易于纯合、生长周期短、在温室内可周年生长等优点，因而其遗传转化研究备受关注。自从1986年McCormick等首次用农杆菌介导的方法获得转基因番茄植株以来，番茄的遗传转化研究不断发展，但转化效率有很大差异。

影响农杆菌介导番茄遗传转化的因素很多，如番茄基因型、侵染时间、分化培养基等，其中基因型对植物生长调节剂的专一性，使得需要对每个番茄基因型的转化过程分别进行研究，以寻求不同基因型植株最适合的转化方法，即由于再生受基因型限制，从而使转化变得较困难；外植体大小对番茄的再生也有重要影响，理想的外植体大小为叶片0.5 cm²，外植体的放置方向有近轴面向上和背面向上两种方式，但基本原则是使外植体的伤口与培养基有较好的接触，以利于外植体愈伤组织的诱导和芽的分化；基因型、分化培养基都是基于再生体系而形成的限制，从而使番茄的遗传转化变得更困难。

番茄是植物基因工程中进行遗传转化的重要模式植物之一。目前在番茄的遗传转化过程中还存在一些问题，如转化率低，转化体、转化植株后代遗传不稳定，操作复杂等。这些问题阻碍了番茄基因工程的研究。因此，建立高效的番茄遗传转化体系，为植物功能基因研究及基因工程改良提供高效的遗传转化平台，从而促进其产业化发展。农杆菌所携带的目标基因能否成功转入到植物基因组中，对后续实验有着重要影响。在常规的农杆菌介导的植物遗传转化方法中，常选用的外植体为具有分生能力的细胞、幼嫩的组织、子叶及下胚轴等，也采取预培养等使细胞处于感受态的技术，这些都有利于转化率的提高。但目前这些方法转化效率还很低、操作过程也较繁琐，实验周期较长。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于克服现有番茄遗传转化效率低、转化周期长及操作过程繁琐的难点，提供一种番茄种子整体侵染的方法，从而提高番茄的转效率。

本发明是按以下技术方案实现的：

一种番茄遗传转化的方法，该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的，步骤包括：① 测成熟番茄种子的生理吸胀曲线，② 含有目标基因的发根农杆菌培养，③ 番茄种子消毒灭菌，④ 结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD₆₀₀值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时，⑤ 在25℃黑暗条件下共培养3天，⑥ 抗性植株的筛选，⑦ 抗性植株的生根及培育，⑧ 转化植株炼苗及移栽等步骤；其中：

步骤 ① 所述测成熟番茄种子的生理吸胀曲线的方法是：取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取1份浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时；

步骤 ② 所述含有目标基因的发根农杆菌培养的方法是：将发根农杆菌A4在LB固体培养基平板上接种活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有50 ug·ml^-1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5-8小时，然后取1 ml 转接于50 ml 含有50 ug·ml^-1卡那霉素和110 umol·L^-1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养12-16小时后，取50 ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25^oC、转速3500 rpm条件下离心10 分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含6 mg·L^-1 6-BA 和 110 umol·L^-1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD₆₀₀值为0.8-1.3备用；

步骤③ 所述番茄种子灭菌的方法是：挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5-2小时，Cl2灭菌20分钟，无菌水冲洗5-6次，准备侵染用；