[发明专利]一种番茄遗传转化的方法

权利要求书

1.一种番茄遗传转化的方法，该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的，步骤包括：① 测成熟番茄种子的生理吸胀曲线，② 含有目标基因的发根农杆菌培养，③ 番茄种子的消毒灭菌，④ 结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD₆₀₀值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时，⑤ 在25℃黑暗条件下共培养3天，⑥ 抗性植株的筛选，⑦ 抗性植株的生根及培育，⑧ 转化植株炼苗及移栽。

2.根据权利要求1所述的一种番茄遗传转化的方法，其特征在于：

步骤 ① 所述测成熟番茄种子的生理吸胀曲线的方法是：取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取1份浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时；

步骤 ② 所述含有目标基因的发根农杆菌培养的方法是：将发根农杆菌A4在LB固体培养基平板上接种活化2次，挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有50 ug·ml^-1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26 ^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5-8小时，然后取1 ml 转接于50 ml 含有50 ug·ml^-1卡那霉素和110 umol·L^-1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26 ^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养12-16小时后，取50 ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25 ^oC、转速3500 rpm条件下离心10 分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含6 mg·L^-1 6-BA 和 110 umol·L^-1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD₆₀₀值为0.8-1.3备用；

步骤③ 所述番茄种子灭菌的方法是：挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5-2小时，Cl₂灭菌20分钟，无菌水冲洗5-6次，准备侵染用；

 步骤④ 所述结合番茄种子的生理吸胀曲线，侵染番茄种子7-9小时的方法是：结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到装有步骤② 制备的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，于26 ^oC，166 rpm条件下振荡培养7-9小时；

 步骤⑤ 所述的共培养的方法是：待步骤④ 侵染7-9小时后，从摇床中取出三角瓶置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次后，置于共培养培养基上，25 ℃黑暗条件下，共培养3天；共培养的培养基是指：在MS培养基中加入 6 mg·L^-1 6-BA 和 110 umol·L^-1 乙酰丁香酮 和 7 g·L^-1 琼脂，pH值5.80-5.82；

步骤⑥ 所述抗性植株的筛选其方法是：将经步骤⑤ 共培养的种子，转接到压力筛选培养基上培养1.5-2个月，获得抗性植株；压力筛选培养基是由1/2MS 培养基中加入 0.2 mg·L^-1 6-BA 和1 mg·L^-1 IBA和 250 mg·L^-1 Cef 和50-100 mg·L^-1 Kan 组成；

 步骤⑦ 所述抗性植株的生根及培育的方法是：将步骤⑥ 筛选之后成活的抗性植株接种在生根培养基上进行生根及培育，置于光照强度为2000 lx，光照时间为12 day / 8 night 的人工气候箱中培养20-30天；生根培养基是由1/2MS培养基加入 0.4 g·L^-1 活性炭组成；

 步骤⑧ 所述转化植株炼苗及移栽的方法是：当步骤⑦ 获得的植株根长达到8 cm左右时，置于温室内开盖2-3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，在温室培养。

3.如权利要求2所述番茄遗传转化的方法，其特征在于：步骤 ② 所述含有目标基因的发根农杆菌是含有Gt基因的发根农杆菌A4菌株。