[发明专利]基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及利用透明颤菌血红蛋白基因在皮尔瑞俄类芽孢杆菌中的表达，因而提高了皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌体对氧的利用率，以提高多肽类抗生素的产量。 

背景技术

农业生产中，化学农药和化学肥料的使用引起环境污染、生态恶化、农业3R问题，对食品安全、人类健康和农业可持续发展构成了巨大的威胁和挑战。因此，发展可持续性农业，就要减少化学农药和化学肥料的使用量，寻找有效的替代品。 

微生物农药和微生物肥料，具有持效期长、不污染环境等特点，是化学农药和化学肥料的最有效的替代品。合理开始和利用微生物农药和微生物肥料，是我国农业持续发展的重要途径。 

农用抗生素是微生物代谢过程中产物的次级代谢产物，在低浓度下即可用于防治植物病虫害或调节植物生长和抗病毒的生物制剂。日本是最早开始使用农用抗生素和进行农用抗生素大规模生产的国家，并率先研制出了用于防治水稻三大病害(稻瘟病、纹枯病和白叶枯病)的抗生素，并实现了产品的工业化生产，此后日本又将有效霉素、春日霉素、多氧霉素、灭瘟素等几十种农用抗生素应用于农用生产，并进一步失去了全球农用抗生素的生产和使用。 

目前美国投入并应用于农业的抗生素达几十个品种，印度已研究开发出了用于防治大麦和水稻等病害的金色制毒素和杂曲霉素；俄罗斯目前已开发出了灰黄霉素、植菌霉素等多种农用抗生素。近十年来，我国研制出的农用抗生素数量不断增加，如西北农林科技大学报道的多肽类抗生素、广东农科院植保所报道的万隆霉素、上海农药研究所报道的金核霉素和磷氮霉素、浙江农科院微生物所报道的抑霉菌素、江西农业大学报道的梅岭霉素、中国医学科学院生物技术研究所报道的波拉霉素，其中多肽类抗生素和波拉菌素已获得国家专利。 

芽孢杆菌因其分布广，易分离培养；生长快、营养简单；对人畜无毒无害，不污染环境；能产生耐热抗逆的芽孢等特点，已受到人们关注。皮尔瑞俄类芽孢杆菌Paenibacillus peoriae是在土壤中发现的具有拮抗作用的细菌。该属细菌 分泌植物激素植物生长素和细胞分裂素，或固氮作用促进植物生长。同时产生多种活性物质，水解酶类如几丁质酶，纤维素酶；多肽类抗生素，一种具有抗细菌活性属于黏菌素一环杆菌素家族，包括如含有二氨基丁酸结构的polypeptim、jolipeptin、gavascrin和saravalin等；另一种具有抗真菌和放线菌活性包括gatavalin和thsaricidim。这些物质起到预防植物病害和抑制植物病原菌作用。 

皮尔瑞俄类芽孢杆菌是一种高好氧细菌，在其工业发酵中后期，由于菌体密度过大造成供氧不足，影响菌体的生长以及次生代谢产物的合成。此外，在施入土壤后，如果土壤中氧气含量低，会影响该菌体的生长的定殖能力，进而影响其防病效果。 

透明颤菌血红蛋白是由透明颤菌属产生的一种可溶性血红蛋白，这种血红蛋白能在贫氧条件下被大量诱导合成，使透明颤菌在微氧条件下能够很好地生存。透明颤菌血红蛋白已经成功克隆到多种细菌中，VHb的表达提高了宿主的耐低氧能力，提高了菌体的密度和代谢产物的产量。1996年Kallio等在含α-淀粉酶的基因工程大肠杆菌中成功表达vgb基因，结果表明VHb的表达使细胞密度提高，同时酶产量得到了数倍的提高。2002年于慧敏等构建了VHb整合型pHB(聚β-羟基丁酸酯Poly-β-hydroxybutyrate)产生菌VG1(Ptu14)，解决了产品生产过程中高耗氧以及高成本的问题。2004年陈文清等将VHb在弗氏链霉菌中获得表达，并提高了泰乐星抗生素的产量。除此之外VHb还先后在十多种原核生物中如链霉菌、根瘤菌、枯草芽孢杆菌、兽疫链球菌等获得了表达，使抗生素、酶、透明质酸等产量得到了提高。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种对氧的利用率高，发酵产孢数和多肽类抗生素产量高的基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌及发酵方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

一种基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌，其中，所述基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌为皮尔瑞俄类芽孢杆菌LXH-B-1的染色体上整合有-P₄₃-vgb-片段。 

上述技术方案所述的基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌，其中，所述-P₄₃-vgb-片段中的P₄₃为启动子。 

一种基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌，其分类命名为Paenibacillus peoriaeBC39，保藏编号为CGMCC NO.5900。