[发明专利]基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌，其特征在于：所述基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌为皮尔瑞俄类芽孢杆菌LXH-B-1的染色体上整合有-P₄₃-vgb-片段。

2.根据权利要求1所述的基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌，其特征在于：所述-P₄₃-vgb-片段中的P₄₃为启动子。

3.一种基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌，其分类命名为Paenibacillus peoriae BC39，保藏编号为CGMCC NO.5900。

4.基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：将来自于透明颤菌血红蛋白基因vgb，构建重组整合载体pIB139-P₄₃-vgb；通过基因重组整合载体pIB139-P₄₃-vgb中含有attP整合位点，将-P₄₃-vgb-片段整合到皮尔瑞俄类芽孢杆菌LXH-B-1的染色体上，获得了基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌。

5.根据权利要求4所述的基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

(1)PCR扩增P₄₃启动子

以枯草芽孢杆菌基因组为模板，以P₄₃-F/P₄₃-R为引物，扩增P₄₃启动子，其中，

P₄₃-F：CCCAAGCTTGATAGGTGGTATGTTTCGCTTG；

P₄₃-R：GGTTTGCTGGTCTAACATGTGTACATTCCTCTTT；

(2)PCR扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb

以质粒pRK404-VHb以模板，Vgb-F/Vgb-R为引物，扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb；其中

vgb-F：TGGTTTGCTGGTCTAACATGCGGCTGGATCCTACCA；

vgb-R：CGGAATTAGGTACCAGCCCGACCCGAGCAC；

(3)重叠延伸拼接P₄₃启动子和vgb

用PCR回收试剂盒回收再次PCR的产物，并以步骤(1)和(2)的回收产物为模板，以P₄₃-F/Vgb-R为引物，采用重叠延伸拼接的方法扩增融合基因，；

(4)基因重组整合载体pIB139-P₄₃-vgb的构建

用PCR回收试剂盒回收步骤(3)的重叠PCR产物，将回收产物连接到pSET152衍生质粒pIB139上，连接体系为4μlPCR产物，5μlSolution I，1μl pIB139载体，16℃连接过夜，连接产物取5μl用来转化E.coli DH10B感受态细胞，加 1ml的无抗LB，放入37℃的摇床预培养1h。取预培养后的菌液放入新的ep管中，加入300ul无抗LB，涂布于含有红霉性抗性的LB平板上37℃培养，次日挑选抗性斑划线。

(5)基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌工程菌BC39的构建

制备皮尔瑞俄类芽孢杆菌LXH-B-1感受态细胞；用BamH I将基因重组整合载体pIB139-P₄₃-vgb线性化，切胶回收，随后将100ng DNA加入200μl感受态中，孵育20min；加入LB和红霉素，培养90min，然后涂布红霉素抗性平板，37℃倒置培养12-16h；挑选抗性菌落，划线到另一个平板；从红霉素平板上挑取转化子，然后在另一个平板上划线培养，同时挑取一部分菌株做Southern杂交，以研究vgb表达框是否真正整合到皮尔瑞俄类芽孢杆菌LXH-B-1的染色体上，采用整合质粒pSET152上的ΦC31attp位点约2.3kb的片段作为探针，与接合子总DNA经BamH I酶切的片段杂交分析鉴定接合子是否完成接合转移。