[发明专利]一种基于表面等离子共振技术的食品中农兽药残留检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品中农兽药残留检测技术。特别是基于表面等离子体共振技术，通过核酸适配体与未标记、标记样品进行特异性竞争识别，采用溶菌酶适配体修饰的传感元件间接检测食品中农兽药残留的方法。

背景技术

近年来，食品安全问题成为攸关民生的焦点问题，而农兽药残留是制约食品安全的首要因素。传统三大类农药之一的有机磷农药，用量大，使用广，残留问题备受关注。啶虫脒因其作为一种光谱杀虫剂，不可避免地存在于果蔬中。孔雀石绿中的化学官能团三苯甲烷可致癌，很多国家已禁用，但仍有渔民在防治鱼类感染真菌时使用，也有运输商用作消毒。世界各地动物性饲料中所使用的抗生素添加剂竟达20余种，如卡那霉素、四环素类等兽药残留。然而，长期使用农兽药会造成添加剂在植物和动物体内的蓄积，人们食用有农兽药残留的食品后，会对人体健康造成很大的危害。因此，建立可靠、快速、灵敏的检测方法是监控农兽药残留的重要手段之一。

经典的检测方法一般依靠液相色谱、气相色谱、气液质联用法，但这些检测仪器价格昂贵，检测成本高，不能进行在线检测。目前，免疫分析技术是农兽药残留快速检测中应用最普遍的技术。然而，现有免疫检测技术在灵敏度、通用性等方面还无法满足实际检测需求；免疫标记物也存在不稳定、容易失活等缺点，限制了相关免疫分析技术的进一步发展。

表面等离子体共振技术具有高灵敏度、响应快、体积小、无须标记、可保持分子的生物活性等优点，成为近十年来发展最快速的检测技术之一，被广泛采用。相对酶联免疫吸附法、生物传感器检测法以及荧光分析法，仍然存在传感芯片检测专一问题，检测成本非常高。例如，采用表面等离子体共振原理检测的仪器BIACore，其常用传感器芯片CM5成本为2000多元人民币。

发明内容

为了解决现有表面等离子体技术在检测农兽药残留时存在芯片专一性、抗体稳定性差、耗材量大、造假昂贵等问题，同时极大提高农兽药残留的检测限，本发明提供了一种采用表面等离子体共振传感器检测食品中各种农兽药残留的方法。该方法具有通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单等优点。

本发明的技术方案为：一种应用表面等离子体共振仪的食品中农兽药残留检测方法，利用同一传感芯片对不同农兽药残留组分的含量进行检测；其特征在于包括以下步骤：

（一）传感芯片表面适配体固定：选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入5-50μL浓度为1-50μg/L已标记生物素的溶菌酶适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上溶菌酶适配体；

（二）对待测农兽药残留组分进行溶菌酶标记，标记方法根据待测物基团不同，所述标记方法包括EDC/NHS法或戊二醛法；

（三）标准溶液配制：用0.01-0.1mol/L（pH＝7.4）的磷酸盐缓冲液配置农兽药残留组分的标准样品储备液，储备液浓度为0.1ng/mL至1mg/mL，用磷酸盐缓冲液将储备液配制成不同浓度的标准溶液，取不同浓度未标记待测残留组分的标准溶液和溶菌酶标记的待测残留组分充分混合后，竞争结合农兽药残留组分相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中溶菌酶标记的农兽药残留组分应不少于加入的适配体量；

（四）建立标准曲线：采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100μL待测混合样品，记录下表面等离子体共振仪光谱图，通过检测溶菌酶的含量，间接检测农兽药残留组分；取不同浓度待测样品的表面等离子体共振谱图稳定值，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；

（五）定量检测：对于未知含量的农兽药残留组分样品进行检测，同样按照步骤（三）进行；采用表面等离子体共振检测仪记录农兽药残留的光谱图；将光谱图中残留组分的稳定值代入相应的回归曲线方程，计算出食品中农兽药残留组分的浓度值；

（六）通入0.01-0.05mol/L（pH为2-3）的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它农兽药残留检测。

所述标记方法包括EDC/NHS法交联羧基与氨基或戊二醛法交联两个氨基。

可以采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。

所述步骤（一）传感器表面适配体固定，包括如下步骤：

（1）将链霉亲和素SA修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中，在工作通道中进行在线传感表面修饰；

（2）通入0.02mol/L（pH＝7.4）的磷酸盐缓冲液；

（3）通入5-50μL浓度为1-50μg/L生物素修饰的溶菌酶适配体溶液，进行在线偶联至基线稳定；