[发明专利]一种小动物肝脏特异性基因转染方法以及以其为基础的转基因小动物模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及小动物肝脏特异性基因转染方法以及转基因动物模型的构建方法，特别是涉及一种以眼底静脉丛注射技术和静脉高压转染技术(水动力法)为基础的小动物肝脏特异性基因转染方法及其在构建转基因动物模型中的应用。

背景技术

眼底静脉丛注射技术是生物医学实验中的一种常规技术。该技术作为一种常规的实验手段，可以将一系列外源物质递送到活体动物静脉血管内。通常，在生物实验中，该技术可以作为治疗性细胞输注、药物静脉内递送和外源基因转染的方法。与其它静脉注射方法相比，该方法有操作简单方便、适于重复进行和对实验动物损伤小等优点。更为重要的是，该技术适用于某些无法通过其他静脉途径进行外源物质递送的实验动物身上，这样就克服了尾静脉注射技术等传统注射技术无法逾越的技术鸿沟。

静脉高压注射转染法(水动力法)是一种较新的活体动物基因转染方法。该方法可以被定义为，通过将大剂量的含有目的基因重组质粒的生理盐水溶液快速注入实验动物静脉内，进而使目的基因特异性的高效表达于实验动物的肝组织细胞中的活体动物基因转染方法。其中，在该类型的基因转染方法中，应用最为广泛的是尾静脉水动力转染法，在动物实验和实验动物造模过程中常常可以见到该方法的应用。然而，这种经典的活体动物转染技术也有其难以克服的局限性，如仅仅适用于某些尾静脉明显且容易穿刺的实验动物身上(如小鼠、大鼠)，而其他一些尾静脉不明显或根本没有尾静脉的动物则无法使用(如新生鼠)。因此，该方法被局限的应用在大、小鼠的动物实验当中，如果希望该方法在其他类型的实验动物身上使用，就必须对其进行改进。因此，迫切需要一种简单方便、适于重复进行和对实验动物损伤小，且适用范围广泛(可用于多种实验动物)的活体动物体内基因转染方法。

发明内容

针对现有的实验动物静脉高压注射转染法(水动力法)适用范围较小、重复操作困难等问题，本发明的目的是提供一种简单方便、适于重复操作和对实验动物损伤小、适用范围广泛(可用于多种实验动物)，以眼底静脉丛注射技术和静脉高压注射转染法为基础的小动物肝脏特异性基因转染方法。

本发明所提供的基因转染方法，是将超过2μg的携带有目的基因的重组表达质粒溶解于相当于实验动物体重4-10％的生理盐水，以5-25秒的速度注射入实验动物的眼底静脉丛内，8-36小时后目的基因在实验动物肝脏处获得表达。

在上述基因转染方法中，所述携带有目的基因的重组表达质粒的注射量优选为5-50μg，尤其优选为10μg；所述生理盐水的注射量优选为相当于实验动物体重6-10％，尤其优选为10％；所述注射速度优选为5-12秒，尤其优选为8秒；所述目的基因的表达时间优选为8-24小时。

所述目的基因的选择是广泛的，可根据需要构建的实验动物模型进行选择，外源基因既可以是只表达指示作用的报告基因，如萤火虫荧光素酶(Fluc)基因、分泌型Gissass荧光素酶(Gluc)基因、β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因等，还可以是具有治疗作用、模拟疾病感染或有其他应用前景的目的基因，如HBV基因或HCV基因等；用于构建携带有目的基因的重组质粒的出发质粒可为任意一种表达外源基因的真核表达质粒，如pCI-neo、pcDNA、pGL、pVAX或pNFkB-Luc等；以pCI-neo为出发质粒构建的携带Gluc基因的重组表达质粒为pCI-Gluc，以pGL3为出发质粒构建的携带Fluc基因的重组表达质粒为pCMV-Fluc，以pcDNA为出发质粒构建的携带lacZ基因的重组表达质粒为pCMV-β-Gal。

所述实验动物的选择也是广泛的，可根据需要构建的实验动物模型进行选择，如成年鼠、新生鼠、乳鼠、树鼩等，优选为6-8周龄的成年鼠、新生24小时内的新生鼠、新生1-7天的乳鼠、成年或新生树鼩。

本发明还提供了一种构建转基因小鼠模型的方法，包括下述步骤：

1)构建携带目的基因的重组表达质粒；

2)将携带有目的基因的重组表达质粒溶解于相当于实验动物体重4-10％的生理盐水，以5-25秒的速度注射入实验动物的眼底静脉丛内，8-36小时后目的基因在实验动物肝脏处获得表达，得到转基因小鼠模型。

所述目的基因为HBV或HCV全基因组基因。