[发明专利]大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及环境样品DNA提取的预处理方法，特别涉及大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法。

背景技术

中国白酒是世界六大蒸馏酒(威士忌、白兰地、金酒、伏特加、朗姆酒、中国白酒)之一，其酿造历史悠久，酿造工艺独特。在大曲酒的酿造过程中，窖泥发挥着重要作用，是大曲酒发酵不可缺少的先决条件。

大曲酒酒质直接与窖泥的质量密切相关。按大曲酒酿造传统，50年以上的老窖可生产特头曲酒，20年左右窖龄的酒窖只能出产二、三曲。新窖泥为纯黄泥，熟化过程中，泥色逐渐由黄转乌，最后呈乌黑带灰色，间或出现红绿色彩，手感由初期的粘性绵软变为熟化后的质软无粘性。在此过程中，酿酒酒糟和窖池黄泥不断接触，香味物质、微生物、营养物质等组分互相渗透、不断积累，形成了独具特色的大曲酒窖泥。窖泥是各种有益微生物的载体和栖息场所，微生物在窖泥中不断繁殖，形成了丰富多样、生命活力旺盛的微生物类群，并构建了特殊的微生态体系。窖泥微生物参与的各种生香和发酵作用，实现了窖泥自身的新陈代谢。窖泥形成过程中，其中的有益微生物包括乳酸菌、己酸菌、甲烷菌、丁酸菌、产甲烷古菌等类群参与了大曲酒的生香过程，生成了包括乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯等系列呈香物质，因而熟化后老窖泥带有浓郁的窖香，窖龄越长，酒质越好。

基于大曲酒窖泥在中国白酒酿造中的重要性，相关专家一直致力于研究该体系中微生物种群及其作用。目前，对窖泥中特殊微生物生态体系的研究，多采用传统的可培养微生物研究技术进行种群特性分析，由于窖泥环境的复杂性，加之大量微生物无法获得纯培养，利用传统可培养微生物研究技术只能认识大曲酒窖泥复杂微生物体系中的极少部分。采用现代分子生物学技术，从环境样品直接提取DNA进行研究，有利于全面揭示传统中国白酒窖泥的微生物种群特点。要开展窖泥微生物体系研究，首先必须获得高质量的窖泥样品总DNA，由于窖泥除了含有高浓度的乙醇及其他醇类外，还含有乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯等呈香物质以及其他有机酸、酯类和腐殖质等，这些物质严重干扰了窖泥微生物总DNA的提取。现有专利中，已有公开号为CN101684137A的中国发明专利介绍了从白酒大曲中提取微生物总DNA的方法，其核心在于提取DNA之前对含有大量杂质的大曲样品进行前处理。但因大曲和窖泥形成环境不同、组成成分差异大，提取总样品DNA时所采取的前处理方法也会不一样，迄今也未见提取窖泥DNA前处理的报道。

尽管从土壤样品中提取微生物总DNA的方法很成熟，土壤DNA提取试剂盒也已普遍应用，但因窖泥组成体系复杂，加之富含醇类、酯类、有机酸类、腐殖质等物质，严重影响了窖泥样品总DNA的提取效率和质量，采用现有方法获取高质量窖泥总DNA仍然相当困难。

发明内容

基于上述现状，针对窖泥本身的特点，本发明提供了一种有效提取窖泥样品微生物总DNA的前处理方法，可有效除去干扰窖泥DNA提取的醇类、酯类、有机酸及其他有机物，经过前处理的窖泥，采用土壤样品DNA常规提取方法，可顺利获得高质量的窖泥样品DNA。经检测，其大小为23.1Kb左右(图1a)，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.825，不需进一步纯化，即可进行16S rDNAPCR、PCR-DGGE分析，从而为系统研究窖泥微生物分子生态奠定了基础。

本发明涉及的提取大曲酒窖泥DNA的前处理方法如下：

一种大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法，包括以下步骤：

(1)称取适量窖泥，放入灭菌的离心管中，加入灭菌生理盐水(按照质量百分比计，含0.4％-0.6％吐温-80)，充分振荡3-5min，4℃，9000r/min离心12min，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次；

(2)向上述样品加入无水乙醇，充分振荡3-5min洗涤样品，4℃，9000rpm离心12min，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次；

(3)加入无菌超纯水，混合均匀，振荡3-5min，洗涤样品，4℃，9000rpm离心12min，弃去上清液；

(4)将充分洗涤的窖泥样品用双层灭菌纱布包裹离心管口，-70℃冷冻30min，低温真空抽干至粉状，保存于-20℃冰箱，用于提取窖泥微生物总DNA。

所述步骤(1)-(3)中，洗涤用灭菌生理盐水、无水乙醇、无菌超纯水的加入量，按窖泥与溶液的重量体积比1∶1-2比例添加。

所述方法，从经过预处理的大曲酒窖泥中提取微生物总DNA的步骤包括：