[发明专利]低免疫原性猪真皮支架的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低免疫原性猪真皮支架的制备方法。

背景技术

异体脱细胞真皮基质（Allo-ADM）是以包含表皮、基底膜及乳头层真皮的断层人尸体皮片为原材料，采用物理、化学、生物等两种或两种以上脱细胞方法联合处理而制成，保留了免疫原性较弱的胶原蛋白（collagen，Col）以及部分弹性纤维(elastic fiber)、蛋白多糖(proteoglycan)和结构性糖蛋白(structural glycoproteins)等基质成分，亦保留了真皮天然的三维结构和连接表皮与真皮的基底膜。虽然在Allo-ADM的基础研究和临床应用方面有很大进展，并在以烧伤为主的多学科应用中取得较好的移植效果，但仍有许多基础理论与实际应用问题有待研究解决：①异体皮来源有限，由异体皮制作的ADM价格昂贵，限制了其临床应用；②具有传染疾病的潜在危险；③屏障功能不完善，抗感染能力较弱，对移植床要求条件较高；④Allo-ADM移植后渗透性差、血管化速率慢，与自体刃厚皮即时复合移植（一步移植法）成活率低。

异种脱细胞真皮基质（Xeno-ADM）的制备方法与Allo-ADM基本相同，取包含表皮、基底膜及乳头层真皮的新鲜断层猪皮肤，经脱细胞处理制成Xeno-ADM，保留了Col Ⅰ、Ⅲ为主的天然真皮三维网络空间结构及部分Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）、层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白（FN）、细胞外粘连蛋白（VN）、巢蛋白（entactin）、蛋白多糖，亦残留不能完全脱除的细胞相关抗原成分。检索近年有关Allo-ADM和Xeno-ADM基础研究与临床应用方面的文献并综合分析， Xeno-ADM虽然展示了良好的研究与应用前景，但现阶段无论从引发宿主的炎症-免疫反应，还是到包括动物实验和临床试用在内的实际效果，Xeno-ADM移植物都难以与Allo-ADM相媲美，其中较强的免疫原性及其诱发的炎症-免疫反应是Xeno-ADM存在的突出问题。

DeSagun EZ等用抗Xeno-ADM血清进行免疫组化实验，Xeno-ADM内的ColⅠ、Ⅲ不发生反应，而基底膜区域反应最强，Ninomiya亦指出基底膜Col Ⅳ中α( Ⅳ)NCL 结构域有明显的抗血管生成活性。以上均提示富含LN、Col Ⅳ等成分的基底膜亦包括皮肤附属器和血管基膜，可能是Xeno-ADM免疫原的主要来源。另外，任何脱细胞方法都不能完全脱除细胞碎片成分，成为Xeno-ADM免疫原的另一来源。此外，Allo-ADM移植后渗透性差、血管化速率慢，屏障功能不完善等问题同样存在于Xeno-ADM。

Xeno-ADM植入人体后诱发的炎症-免疫反应及由此引发的宿主排斥移植物反应是限制Xeno-ADM在临床上广泛应用的首要问题，如何在Xeno-ADM的制备工艺上加以改良，尽可能的去除导致其高免疫原性的LN、Col Ⅳ等成分，并同时最大限度的保留Col Ⅰ、Ⅲ等低免疫原性成分及其为基础的天然真皮三维网络结构，是值得深入研究的课题。

发明内容

本发明的目的是，提供一种低免疫原性猪真皮支架的制备方法，它是以猪皮肤为原料，以保留猪真皮胶原纤维等低免疫原性成分及其为基础的天然三维结构、去（脱）除细胞和层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白（FN）等基质蛋白等高免疫原性成分为目标要求，通过改进皮肤取材及处理、优选脱细胞方法、建立脱基质蛋白技术、优选交联剂、真空冷冻干燥技术等手段，制备低免疫原性猪真皮支架材料。它可达到降低猪真皮免疫原性至人体能够耐受的水平，同时保留其天然三维结构，以原位构建组织工程化组织方式引导人真皮“有序”再生重建的目的，从而，可解决现有技术存在的问题。