[发明专利]低免疫原性猪真皮支架的制备方法

权利要求书

1.低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

①制备“双断层”真皮：a.将家猪处死去毛，剥离其皮肤和部分皮下组织，消毒冲洗；

b.先削除皮肤的表皮及真皮乳头层，再削除皮下组织及与其相连的真皮部分网状层,保留0.5-0.6mm厚真皮网状层，即为“双断层”真皮；

②脱细胞处理：a.配制2.5U/ml中性蛋白酶（Dispase II）溶液及体积分数0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）溶液；

b.先将步骤①中所述“双断层”真皮置于2.5U/ml Dispase II溶液中，于4℃条件下作用24h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层”真皮至少需要2.5ml的2.5U/ml Dispase II溶液；再将“双断层”真皮取出，PBS洗涤3次，每次5min；然后，将“双断层”真皮置入体积分数0.5% TritonX-100溶液中，于4℃条件下作用24h，每平方厘米的“双断层”真皮至少需要5ml的体积分数0.5% TritonX-100溶液；取出“双断层”真皮，PBS洗涤5次，每次5min；该工序能脱除“双断层”真皮中的细胞成分，将其制成 “双断层”异种脱细胞真皮基质，即“双断层”Xeno-ADM；

③基质金属蛋白酶-7 (MMP-7)处理：先将步骤②所述“双断层”Xeno-ADM置于0.5 U/ml MMP-7溶液中，于4℃条件下作用12-16h，再于37℃条件下作用8h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层” Xeno-ADM需要至少2.5ml的MMP-7溶液浸泡；再将“双断层”Xeno-ADM取出，PBS洗涤3次，每次5min；然后，将“双断层”Xeno-ADM置入体积分数0.5% TritonX-100溶液内，于25℃下，振荡洗涤24h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层”Xeno-ADM至少需要5ml体积分数0.5% TritonX-100溶液进行振荡洗涤；PBS充分洗涤5次，每次10min；该步骤处理能脱除“双断层”Xeno-ADM中层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）及其他高抗原性成分，将“双断层” Xeno-ADM制成网状层真皮支架；

④真空冷冻干燥处理：将上一步骤的网状层真皮支架在－40℃条件下冷冻1h，之后抽真空17h，以进一步降低网状层真皮支架免疫原性，扩大其相对空间结构，提高渗透性，从而制成低免疫原性猪真皮支架。

2.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：经步骤③处理后得到的网状层真皮支架，在进行步骤④真空冷冻干燥处理前，先应用京尼平（Genipin）处理，以增强网状层真皮支架的韧性、降低其降解速率；京尼平（Genipin）处理操作如下：网状层真皮支架应用0.5%（w/v）的京尼平（Genipin）溶液，在25℃下交联6h；之后，再置入25%（w/v）饱和甘氨酸溶液中中和多余的京尼平（Genipin），每平方厘米的0.5-0.6mm网状层真皮支架至少需要在2.5ml的25%（w/v）饱和甘氨酸溶液中进行中和处理。

3.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：完成步骤①中所述的b工序的设备是用皮革剖层机。

4.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：所述步骤②的b工序中所述的所有操作过程，都辅以连续振荡。

5.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：所述步骤④的a工序由真空冷冻干燥机完成。

6.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：所述步骤①中的“双断层”真皮的切取尺寸为100mm×100mm。

7.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：步骤①中b工序所述, 先削除皮肤的表皮及真皮乳头层，再削除皮下组织及与其相连的真皮部分网状层；被削除的表皮及真皮乳头层厚度是1-2mm，被削除的皮下组织及与其相连的真皮部分网状层厚度是1.5-2.5mm，确保保留真皮网状层厚度为0.5-0.6mm。

8.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：步骤①中a工序所述消毒冲洗具体操作如下：将所述的皮肤和部分皮下组织置入0.1%（w/v）新洁尔灭溶液中浸泡消毒10-15min，取出后用等渗盐水冲洗3次，再置抗生素盐水溶液中浸泡10min；抗生素盐水溶液是由每500ml等渗盐水中加庆大霉素32万U而制得的溶液。