[发明专利]一种利用SLP将功能蛋白定向固定的方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白固定化领域，具体涉及一种利用SLP将特定功能蛋白定向固定到介质表面的方法。

背景技术

细菌表面自组装蛋白(Crystalline bacterial cell surface layers，S-layers，S-layer protein，SLP)是一种存在于多种古细菌与细菌表面的蛋白质，在细胞膜表面形成规则的网格结构，起到稳定细胞膜的作用。游离的SLP单体可以在各种固体表面(如多聚合物、硅片及金属)及两相界面(如气液表面、脂膜表面或脂质体表面)通过静电作用力、离子作用力和疏水作用力自发组装成规则的、厚度约为5～28nm、由大小约3～35nm的网格单元组成的单分子层网格结构。SLP的这种自组装特性使其在生物纳米技术上极具应用潜力。

功能蛋白(如酶、抗体、抗原、多肽等)在生物工程中具有广泛的应用。但功能蛋白一般为水溶性分子，对环境因素(如pH值、离子强度、温度等)比较敏感，环境因素的轻微改变即可使蛋白质结构和功能发生改变。因此，在研究和生产活动中，常采用蛋白固定化技术将功能蛋白固定到介质表面以增加其结构和功能的稳定性。蛋白质固定化后其结构与功能的稳定性增加，通过常规方法即可将其从反应系统中分离，生产过程易于控制。固定化的蛋白能反复多次使用，且便于运输和贮存，有利于自动化生产。然而，目前常用的蛋白固定化方法常使功能蛋白的活性降低，使用范围缩小。下面简述目前常用的4种蛋白固定化方法及其优缺点。

一、吸附法

1.物理吸附法：利用各种吸附剂将蛋白质分子吸附在其表面从而实现固定化。常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多空陶瓷、多空玻璃等。此方法操作简单，条件温和，但吸附不具备特异性，吸附力较弱，蛋白质容易脱落。

2.离子吸附法：蛋白质通过离子键吸附于有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。用于此法的载体有阴离子交换剂如DEAE-纤维素，DEAE-葡萄糖凝胶，Amberlite IRA-93，IRA-410，IRA-900；阳离子交换剂如羧甲基纤维素，Amberlite CG-50，IR-120，Dowex-50等。离子吸附法操作简单，处理条件温和。但是固定化的蛋白质容易受缓冲液影响，在离子强度高的条件下进行反应时，往往会从载体上脱落。

二、包埋法

包埋法可分为网格型和微囊型两种。将蛋白质包埋于高分子凝胶细微网格中的称为网格型，包埋于高分子半透膜中的称为微囊型。包埋法几乎不改变蛋白的高级结构，蛋白活力回收率较高。但是在包埋时发生的化学聚合反应，容易使蛋白的活力降低，需要设计适宜的反应条件，而且蛋白分子在聚合物中呈随机分布，排布散乱，有效活性位点朝向不一致而导致整体活力下降。

三、共价结合法

蛋白的非必需基团通过共价键和固相支持物形成不可逆的连接。所用载体主要有：天然有机载体、无机载体、合成聚合物等。蛋白分子中可以形成共价键的基团主要有：α-氨基或ε-氨基，α、β或γ位的羟基、巯基、咪唑基、酚基等。首先将载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活性基团，然后此活性基团与蛋白分子上的某一基团反应，形成共价键。用共价偶联法固定化蛋白，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，可以连续使用很长时间。但载体活化的操作复杂，而且由于采用了比较剧烈的反应条件，会导致蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心，而且固定化的蛋白不具备方向性，排布散乱，有效活性位点朝向不一致而导致整体活力下降。

四、交联法：

借助于双功能或多功能试剂使蛋白质之间发生交联反应，制成不溶于水的网状结构。参与交联反应的蛋白的功能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨基的巯基和组氨酸的咪唑基等。交联剂有形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或N，N’-乙烯双马来亚胺等。交联法的反应条件比较强烈，蛋白质活力回收率一般较低。

以上几种方法固定的蛋白质分子均无方向性，活性利用率低，并存在或结合不牢固、或操作复杂剧烈等缺点。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种将特定功能蛋白定向固定到介质表面的方法，该方法是通过基因工程的手段将SLP进行改造，保留其自组装的特性，使其作为融合表达标签与各种功能蛋白进行融合表达，形成SLP融合蛋白，再将SLP融合蛋白固定到介质表面，从而实现功能蛋白的定向固定化。

本发明的目的通过下述技术方案实现：