[发明专利]一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类基因工程领域，具体地说，是一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法，及其在金鱼Tgf2转座子插入位点检测中的应用，适用于在金鱼和养殖鱼类Tgf2转座子介导的转基因或插入诱变后代中进行快速准确的开展基因组插入拷贝数和侧翼序列的鉴定。

背景技术

DNA转座子(transposon)是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗传因子，其变更插入位置的过程称为转座(transposition)。很多不同的转座子(如P因子和Mos1)介导的基因组插入诱变已被作为大规模遗传筛选的工具，不仅在单细胞生物如细菌和酵母中，而且在多细胞生物包括蠕虫、果蝇和拟南芥的研究中都被证明是成功的，它们为发现和解码这些生物的性状主控基因作出了巨大的贡献。近年来，我们在一些金鱼品系中发现了一个新的、具有天然转座活性hAT 家族转座子，为近年发现的第二例具有天然转座活性的脊椎动物转座子，根据国际转座子的命名标准，命名该转座子为Tgf2 转座子。Tgf2 转座子来源于鲤科鱼类，其在鲤科养殖鱼类中的转基因整合率约为50％，是第1代线性化质粒注射方法的10倍。与昆虫piggyBac转座子倾向插入TTAA和Tc1/mariner转座子家族偏好AT位点相比，鲤科 Tgf2转座子为随机插入，这为开辟鲤科养殖鱼类全基因组插入诱变研究奠定了物质基础。

目前，进行转座子在生物基因组插入拷贝数和侧翼序列一般采用反向PCR (inverse PCR)方法。反向PCR在扩增前先用限制性内切酶酶切样品基因组DNA，再用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，然后通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段，并进行测序，从而获得插入拷贝数的侧翼序列和拷贝数。反向PCR方法存在一些缺点和不足，例如，1、酶切、自连过程受到很多不确定因素的影响，需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段，这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA；2、为提高分子间连接的效率，连接反应中基因组DNA的浓度要低，因为高浓度的DNA可能会提高非同源连接水平，从而产生非特异扩增；3、成环的双链DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反应，它只可以扩增出较短的DNA片段；4、鱼类转座子插入位点存在多拷贝，反向PCR引物可能与多个基因序列杂交，严重干扰转座子插入位点侧翼序列的鉴定。

中国专利文献CN101962659A公开了一种基于Tgf2转座子的鱼类基因转移载体及其制备方法，由转基因供体质粒和辅助质粒组成，转基因供体质粒由鱼类启动子序列，如斑马鱼Krt8启动子、目的基因、以及金鱼Tgf2转座子左右臂序列构建，辅助质粒由斑马鱼β-actin启动子和金鱼Tgf2转座酶编码基因构建，为进行鱼类转基因研究提供了新方法。中国专利文献CN101962660A公开了一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法及其载体和载体的制备方法，通过注射转基因供体质粒，并辅以基于Tgf2转座酶mRNA两种载体，共同注射入鱼类1-2期细胞期受精卵，即可实现高效转基因，与常规鱼类转基因技术相比，具有整合效率高、负载容量大、通用、安全和高效的优点。但是关于一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法，所述的方法包括以下步骤：（1）通过对带有Tgf2转座子的金鱼基因组DNA提取；（2）再对全基因组DNA进行限制性内切酶酶切；（3）酶切好的DNA片段与splinkerette接头连接；（4）接下来分别进行第一轮 PCR和第二轮 PCR分别扩增转座子插入位点5'和3'侧翼序列，对第二轮PCR产物进行克隆和序列测定，从而检测出Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列，并推测插入的拷贝数，所述的检测出的Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列数即为插入的拷贝数。

所述的步骤（1）中的金鱼基因组DNA带有Tgf2转座子插入位点，包括基因组本身带有Tgf2转座子的金鱼各品系，以及通过转座方式插入Tgf2转座子的其他鱼类。

所述的步骤（2）中的限制性内切酶为Sau3A1，酶切好的DNA片段带有GATC粘性末端。

所述的步骤（3）中的splinkerette接头包含长序列SEQ ID No:1和短序列SEQ ID No:2。