[发明专利]一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法

权利要求书

1.一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：（1）通过对带有Tgf2转座子的金鱼基因组DNA提取；（2）再对全基因组DNA进行限制性内切酶酶切；（3）酶切好的DNA片段与splinkerette接头连接；（4）接下来分别进行第一轮 PCR和第二轮 PCR分别扩增转座子插入位点5'和3'侧翼序列，对第二轮PCR产物进行克隆和序列测定，从而检测出Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列，并推测插入的拷贝数，所述的检测出的Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列数即为插入的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中金鱼基因组DNA带有Tgf2转座子插入位点，包括基因组本身带有Tgf2转座子的金鱼各品系，以及通过转座方式插入Tgf2转座子的其他鱼类。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中限制性内切酶为Sau3A1，酶切好的DNA片段带有GATC粘性末端。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中splinkerette接头包含长序列SEQ ID No:1和短序列SEQ ID No:2。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的splinkerette接头的合成步骤为：把权利要求4所述的splinkerette接头长序列与短序列等浓度等体积混合，95℃保温5min，然后以1℃/15s逐步降至4℃，长序列与短序列退火形成splinkerette接头。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的splinkerette接头一侧带有段序列的GATC粘性末端，另一侧带有由于短序列中的AT碱基互补配对形成一个7bp的发卡结构而形成错配区。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中酶切好的DNA片段与splinkerette接头均带有GATC粘性末端，通过T4连接酶连接，形成酶切DNA片段两端带有splinkerette接头的DNA片段。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（4）中进行转座子插入位点5'侧翼序列扩增的第一轮 PCR，所用引物为Splink1：SEQ ID No:5和Tgf2-5'GSP3: SEQ ID No:3；对第一轮PCR产物稀释50倍，并进行第二轮 PCR，所用的引物为：Splink2: SEQ ID No:6和Tgf2-5'GSP4：SEQ ID No:4，对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，检测出Tgf2转座子在金鱼基因组5'侧翼序列，并推测出插入拷贝数。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（4）中进行转座子插入位点3'侧翼序列扩增的第一轮 PCR，所用引物为：Splink1: SEQ ID No:5和Tgf2-3'GSP1: SEQ ID No:7；对第一轮PCR产物稀释50倍，进行第二轮 PCR，所用的引物为：Splink2: SEQ ID No:6和Tgf2-3'GSP2: SEQ ID No:8，对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，检测出Tgf2转座子在金鱼基因组3'侧翼序列，并推测出插入拷贝数。