[发明专利]一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于ATP浓度检测领域，特别涉及一种T淋巴细胞增殖活性后细胞内ATP浓度检测试剂盒及其制备和应用。

背景技术

T细胞是淋巴细胞的主要组分，按其在免疫应答中的功能又可分为CD4细胞(Th辅助淋巴细胞)和CD8细胞(Tc细胞毒T细胞)等。

CD4细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞。通过检测CD4细胞内代谢标记物ATP的浓度水平，可直接反映CD4细胞数量或增殖转化的活性，从而反应机体免疫功能水平。

ATP作为最重要的能量分子，在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用。ATP水平的改变，会影响许多细胞的功能。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，ATP水平会下降，而高葡萄糖刺激等对于一些细胞可以上调细胞内ATP水平。通常ATP水平的下降表明线粒体的功能受损或下降，在细胞凋亡时ATP水平的下降通常和线粒体的膜电位下降同时发生。

目前检测淋巴细胞增殖转化的实验室方法主要有细胞涂片染色法(形态法)，放射性核素示踪法(胸腺嘧啶(³H-T)掺入法)和MTT比色法。形态学方法简单易行，但判读结果易受主观因素影响，重复性和可靠性较差；胸腺嘧啶(³H-T)掺入法通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力，但存在环境污染的风险，使其广泛应用受限；MTT法简单、快速，但可以敏感性较差，量程较窄；本发明通过测量CD4细胞内ATP的浓度，快速测定受抗原刺激后CD4细胞的增殖反应，克服了上述方法诸多缺陷，具有灵敏度高，特异性好，检测结果稳定可靠，无放射性污染，测定浓度范围宽等优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒及其制备和应用。

一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒，所述试剂盒的组成为：细胞培养液、CD4免疫磁珠、洗涤缓冲液、裂解液、酶反应液、ATP标准应用液、96孔检测板和荧光测量板。

所述细胞培养液为RPMI1640，含有100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素。

所述裂解液为含0.05wt％的非离子去污剂Triton X-100溶液。

所述洗涤缓冲液为含1wt％BSA的PBS磷酸盐缓冲溶液，0.4wt％的防腐剂叠氮钠。

所述酶反应液为含1mg/ml荧光素、0.5mg/ml荧光素酶、1mmol/L MgSO₄、0.5mmol/LEDTA、10mmol/L二硫苏糖醇和5mg/ml牛血清白蛋白的甘氨酸甘氨酰缓冲液，pH＝7.6-7.8。

本发明的一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒的制备方法，包括：

(1)细胞培养液：选用RPMI-1640作为细胞培养或稀释用的主要缓冲液成分，分别加入双抗(青-链霉素)至工作浓度(青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml)；

(2)CD4免疫磁珠：取500万个羧基化磁珠于1.5ml离心管中，加入1ml清洗缓冲液，混合均匀并超声洗涤15分钟，磁分离洗涤2遍后，重悬在250μl的2-(N-吗啉基)乙磺酸中，再分别加入500μg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和750μg N-羟基-琥珀酰亚胺，37℃条件下活化磁珠表面的羧基15min，然后用2-(N-吗啉基)乙磺酸洗涤两次，重悬后，加入25μg的CD4单克隆抗体，室温反应2h，将抗体偶联于磁珠表面，得到CD4免疫磁珠；用PBS洗涤偶联后免疫磁珠2遍，加入到50μl的PBS磷酸盐缓冲液中，4℃保存；

(3)洗涤缓冲液：取1克牛血清白蛋白(BSA)溶于0.01mol/LPBS磷酸盐缓冲溶液中，定容至100ml。然后加入4ml的10％的叠氮钠，作为防腐剂；充分混匀后，4℃保存；

(4)裂解液：采用含非离子去污剂Triton X-100的氢氧化钠碱性缓冲溶液作为裂解液，TritonX-100浓度为0.05wt％，pH 12.0-12.6；配制采用去离子纯化水，配制后电导率小于5000μS/cm，4℃保存；

(5)酶反应液：缓冲体系采用甘氨酰甘氨酸缓冲溶液。

A、50mM甘氨酰甘氨酸缓冲溶液配制方法是：先配制50毫升200mM甘氨酸溶液，用200mMNaOH调定pH到7.6，然后加水定容到200毫升即可。