[发明专利]一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒及其制备和应用

权利要求书

1.一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒及其制备和应用，其特征在于：所述试剂盒的组成为：细胞培养液、包被单克隆抗体的CD4磁珠、洗涤缓冲液、裂解液、酶反应液、ATP标准应用液、96孔检测板。

2.根据权利要求1所述的一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒，其特征在于：所述细胞培养液为RPMI1640，含有100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素。

3.根据权利要求1所述的一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒，其特征在于：所述裂解液为含0.05wt％的非离子去污剂Triton X-100溶液。

4.根据权利要求1所述的一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒，其特征在于：所述洗涤缓冲液为含1wt％BSA的PBS磷酸盐缓冲溶液，0.4wt％的防腐剂叠氮钠。

5.根据权利要求1所述的一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒，其特征在于：所述酶反应液为含1mg/ml荧光素、0.5mg/ml荧光素酶、1mmol/L MgSO₄、0.5mmol/L EDTA、10mmol/L二硫苏糖醇和5mg/ml牛血清白蛋白的甘氨酸甘氨酰缓冲液，pH＝7.6-7.8。

6.根据权利要求1所述的一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒，其特征在于：所述ATP标准应用液为1000ng/ml的ATP标准品。

7.一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒及其制备方法，包括：

(1)选用RPMI-1640作为细胞培养或稀释用的主要缓冲液成分，分别加入100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素；

(2)取500万个羧基化磁珠于1.5ml离心管中，加入1ml清洗缓冲液，混合均匀并洗涤，重悬在250μl的2-(N-吗啉基)乙磺酸中，再分别加入500μg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和750μgN-羟基-琥珀酰亚胺，37℃条件下活化磁珠表面的羧基15min，然后用2-(N-吗啉基)乙磺酸洗涤，重悬后加入25μg的CD4单克隆抗体，室温反应2h，将抗体偶联于磁珠表面，得到CD4免疫磁珠；用PBS洗涤偶联后免疫磁珠，加入到50μl的PBS磷酸盐缓冲液中，4℃保存；

(3)取1克牛血清白蛋白溶于0.01mol/L PBS磷酸盐缓冲溶液中，定容至100ml；然后加入4ml的10％的叠氮钠，作为防腐剂；充分混匀后，4℃保存；

(4)采用含非离子去污剂Triton X-100的氢氧化钠碱性缓冲溶液作为裂解液，Triton X-100浓度为0.05wt％，pH 12.0-12.6；采用去离子纯化水配制，配制后电导率小于5000μS/cm，4℃保存；

(5)缓冲体系采用甘氨酰甘氨酸缓冲溶液：

A、先配制50毫升200mM甘氨酸溶液，用200mM NaOH调定pH到7.6，然后加水定容到200毫升；

B、然后，称量500mg的牛血清白蛋白，加入50mmol/L的甘氨酰甘氨酸缓冲液进行溶解，然后加入100mmol/L MgSO₄1ml，50mmol/L EDTA溶液1ml，1mol/L二硫苏糖醇DTT 1ml，甘氨酰甘氨酸缓冲液补充体积定容至100ml，磁力搅拌混匀；

C、在上述步骤B配制的缓冲体系中，加入100mg荧光素、50mg荧光素酶；避光储存于-20℃的冰箱中；

(6)取三磷酸腺苷二钠标准品，无菌去离子水配制成浓度为1000ng/ml的ATP标准应用液；使用时采用上述步骤(4)配制的裂解液稀释1000ng/ml的ATP标准应用液，得到浓度分别为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0ng/ml的ATP标准品试剂；

(7)将步骤(1)～(6)得到的产品制作成基于ATP的淋巴细胞增殖活性检测试剂盒。

8.一种基于ATP的淋巴细胞增殖活性检测试剂盒的应用，其特征在于，具体步骤如下：

(1)通过磁珠免疫法或流式分选进行分离纯化获得CD4细胞，将CD4细胞进行裂解，释放细胞内ATP；

(2)将上述含ATP的样本与酶反应溶液按照体积比1∶3的进行混合，适当混匀后，3-10分钟内同时进行ATP标准品和样本的RLU测定，绘制标准品的ATP浓度-RLU值双对数曲线；

(3)将样本的RLU值代入步骤(2)得到的标准曲线和公式，即可计算得到样本的ATP浓度值。