[发明专利]基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法。

背景技术

高通量测序技术是对传统测序(Sanger测序)一次革命性的改变。传统测序技术一次只能测单一的基因片段，在1990年-2003年首次完成的一个人的全基+因组测序使用的就是传统的Sanger法，花费了十几年的时间，耗费了巨大的资金，动员了多个国家的数百科学家。而高通量测序可一次对几十万到几百万条甚至几千万条DNA分子片段进行序列测定，完成一个人的基因组测序目前达到只需要几天的时间，成本降到几千美元。

高通量测序一般称为下一代测序技术。高通量测序技术包括目前的Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和HiSeq技术、ABI公司的SOLiD技术、Life technologies公司的Ion torrent测序技术、Helicos HeliscopeTM和Pacific Biosciences推出的单分子测序技术，及将要出现的其它高通量测序技术。

高通量测序技术应用前景很广，已经应用到各物种基因组全测序、表观基因组学、宏基因组学及功能基因组学研究的许多方面。虽然这些应用极大地增加了发现与人类疾病息息相关的各种基因突变、短片段插入/缺失、基因组水平异常的机会，但目前还主要停留在研究阶段，还没有作为临床诊断和检测手段，更没有对各种环境下的微生物种群及其比例关系进行鉴定。造成这种现状的主要原因一是现有高通量技术使用成本高，二是还没有一种基于高通量测序的定性定量方法。

目前常用的核酸定性方法是做一个PCR扩增，有产物产生就断定是某种DNA。这种方法虽然简单，但一次只能鉴定一种DNA；又由于PCR非常灵敏，极易被污染造成假阳性结果。研究核酸定量的方法目前是real-time Q-PCR(荧光实时定量PCR)方法。所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团或者荧光探针，利用荧光信号产生时的扩增循环位点(Ct值)与样品中靶标的量有对数关系，实时监测整个PCR进程中荧光信号的累积过程，最后通过与样品中另一参照物或标准曲线进行比对的定量分析方法。因此，靶标定量有两种策略：相对定量和绝对定量。相对定量指的是在样本中靶标量相对于另一参照物的量。绝对定量指的是用已知量的标准曲线来推算靶标的未知量。

在一份核酸混合物样品中利用real-time Q-PCR技术定量分析各成分，除每次主要只能分析一个成分外，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的问题有待解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用real-time Q-PCR来研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录(RT)效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物(参照物)不受实验条件的影响，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键，实验证明要做到这一点是很难的。另外，与传统的PCR技术相比，Real-time Q-PCR的不足之处是：(1)由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；(2)因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了real-time Q-PCR的复合式(multiplex)检测的应用能力；(3)目前real-time Q-PCR实验成本比较高，技术操作难度大，从而也限制了其广泛的应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，解决了现有技术中荧光实时定量PCR方法进行核酸定性和定量检测中的种种不足之处。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)将待捕获的基因组随机打断后采用第一引物进行第一次PCR扩增；所述第一引物一端与标记有生物素的第一接头DNA片段相连，并与待捕获的目的基因区域序列互补结合的寡核苷酸单链序列；

(2)使用捕获组分对进行第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列进行捕获；所述捕获组分包括亲和素和与亲和素结合的固相载体；所述亲和素与所述第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列上的生物素相结合；