[发明专利]基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法

权利要求书

1. 一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）将待捕获的目的基因组随机打断后采用第一引物进行第一次PCR扩增；所述第一引物一端与标记有生物素的第一接头DNA片段相连，并与待捕获的目的基因区域序列互补结合的寡核苷酸单链序列； 

（2）使用捕获组分对进行第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列进行捕获；所述捕获组分包括亲和素和与亲和素结合的固相载体；所述亲和素与所述第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列上的生物素相结合；

（3）使用第二引物对亲和素结合后的目的基因区域序列进行第二次单向PCR扩增；所述第二引物一端与第二接头DNA片段相连，并与所述目的基因区域序列互补结合，且与第一引物进行PCR扩增的方向相反；

（4）将第二次单向PCR扩增后的目的基因区域序列除去亲和素生物素复合物， 获得两端带有相同或不同DNA接头的单链DNA文库；

（5）采用高通量测序技术对获得的单链DNA文库进行测序，然后对测序结果进行核酸的定性分析和定量分析，获得核酸定性定量检测结果。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中固相载体为微球。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中固相载体为磁性微球。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述亲和素选自卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述第一接头DNA片段具有SEQ No：1或3的连续核苷酸序列，且5’端通过生物素进行标记；第二接头DNA片段具有SEQ No：2或4的连续核苷酸序列。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述第一引物进行第一次PCR扩增的第一PCR反应体系包括PCR 缓冲液、dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、待捕获的目的基因区域序列作为模板DNA，所述第一PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液 终浓度1～10 ×；

dNTPs  0.01～1.5mM；

引物序列   终浓度为0.01～2μM；

模板DNA   0.01～10ng/μL；

TaqDNA聚合酶  0.01～1.0U/μL；

MgCl₂   终浓度为0.5～5mM。

7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述第二引物进行第二次PCR扩增的第二PCR反应体系包括PCR 缓冲液、dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、待捕获的目的基因区域序列作为模板DNA，所述第二PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液 终浓度1～10 ×；

dNTPs  0.01～1.5mM；

引物序列   终浓度为0.01～2μM；

模板DNA   0.01～10ng/μL；

TaqDNA聚合酶  0.01～1.0U/μL；

MgCl₂   终浓度为0.5～5mM。

8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（1）中待捕获的基因组是从选自人或动物或微生物群体中提取的。

9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（5）中高通量测序技术选自454焦磷酸测序方法、Illumina Solexa 合成测序方法、ABI SOLiD连接法测序方法、 Life technologies 公司的Ion torrent 测序方法、单分子测序方法。

10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（5）中进行核酸的定性分析和定量分析是利用计算机软件计数和简单的统计分析(t-test)、标准差分析方法来完成。