[发明专利]基于流式细胞术的精子质量评估方法

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及基于流式细胞术的精子质量评估方法。

背景技术

精子质量评估是评判男性生育能力的一项很重要的指标。传统的精子质量评估技术，是采用相差显微镜和专用的血细胞计数板，用肉眼进行观察，主要对精子数量、精子活力和精子形态进行评估和分析。近二十年来，随着计算机技术的不断进步，临床上出现了采用专门的分析软件结合高分辨率的图像采集装置，对精子质量进行评估分析。主要评估的指标与传统精子质量评估方法相同。虽然计算机辅助精子质量评估方法（CASA）减轻了肉眼评估的工作强度，尤其对精子活力的评估较传统方法更加准确，但在精子细胞计数方面，精子和杂质的区分仍然需要人工进行校正。近十年来，又出现了采用荧光显微镜和计算机技术相结合的荧光CASA技术，其优点是采用吖啶橙核酸荧光染料对精子DNA染色，可以很好地将精子细胞和杂质区分开来，提高了精子细胞计数的准确性。无论是传统的精子质量评估方法还是计算机辅助精子质量评估方法（包括荧光CASA），都不可能对全部的精子进行质量评估。用这些方法评估精子质量的统计学数量为400个精子细胞。

采用流式细胞术（FSM）对精子质量进行评估分析，是近几年来刚刚兴起的一项新技术。国外已经有了相关的报道，但仍停留在研究的水平，检测指标比较单一，缺乏标准化，也未见专门的精子多指标联合检测试剂产品或方法出现，使得该技术至今仍无法替代传统的精子质量评估方法，无法在临床上得到广泛的应用。传统的检测精子质量的流式细胞术是采用一个透膜的核酸探针和一个不透膜的核酸探针进行联合检测，这种方法检测精子质量的一个指标容易，但同时检测多个指标较难，如检测精子质膜完整性一个指标比较容易，但是再加入荧光标记物同时检测精子顶体的完整性就比较困难，这涉及到这三种荧光相互之间干扰，使得流式细胞仪的检测不稳定，很难重复。具体地讲，流式细胞术检测细胞是通过激光激发荧光，通过检测细胞的散射荧光强度来评估细胞的性状。如果要检测细胞的多个性状，则需要采用多个荧光标记物，但如果多个荧光标记物的波长比较接近，则流式细胞仪无法区分各个不同波长的荧光强度，造成荧光散射信号的相互干扰重叠。

因此，现有技术存在的缺点如下：（1）统计学分析的数量有限，分析结果的真实性不够；（2）人为因素对结果的影响较大，分析结果的准确性不够；（3）由于分析的统计学数量过少，为确保结果的准确性和重复性，对检测前的实验操作要求很高，工作强度较大；（4）评估分析的实验参数过于笼统，大都为精子细胞的外在表述，缺乏精子细胞内在理化性质的科学判断。

发明内容

本发明的目的在于提供基于流式细胞术的精子质量评估方法。

本发明所采取的技术方案为：

基于流式细胞术的精子质量评估方法，包括如下步骤：首先以透膜的核酸荧光染料及不透膜的核酸荧光染料与待检标本共同染色，然后以荧光标记单克隆抗体与染色后的待检标本孵育，进行流式细胞检测，得出最终检测结果，所述荧光标记单克隆抗体能与精子顶体膜反应，所述荧光标记单克隆抗体与透膜核酸荧光染料、不透膜的核酸荧光染料的激光激发光波长差距均为100～200nm，荧光散射波长差距均为75～150nm。

优选的，荧光标记单克隆抗体与染色后的待检标本孵育后，加入荧光微球，再进行流式细胞检测。

优选的，所述透膜核酸荧光染料为Syto16，不透膜的核酸荧光染料为7-AAD，荧光标记单克隆抗体为APC标记CD46单克隆抗体。

优选的，基于流式细胞术的精子质量评估方法，包括如下步骤：首先以核酸荧光染料Syto16和7-AAD与待检标本共同进行染色，然后以APC标记CD46单克隆抗体与染色后的待检标本进行孵育，最后加入荧光微球，进行流式细胞检测，得出最终检测结果。

优选的，上述方法包括如下步骤：

1)  取液化的精液标本，洗涤，制成细胞悬液； 

2)  向细胞悬液中依次添加终浓度均为2～5 mM的Syto16、7-AAD，37℃下染色，洗涤； 

3)  加入终浓度为1～3 mM的APC标记CD46单克隆抗体，37℃下孵育，洗涤；

4)  加入荧光微球，重悬，上流式细胞仪检测，根据检测数据，得出最终检测结果。

优选的，荧光微球的直径为10 μm。

优选的，步骤2）孵育时间为2～5 min。

优选的，步骤3）孵育时间为20～30 min。

优选的，步骤1）细胞悬液的细胞数为(1～5)×10⁶个。