[发明专利]成年小鼠神经元的机械分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及了一种成年小鼠神经元的机械分离方法。

背景技术

机械分离神经元的膜片钳实验在神经递质受体机制的研究中具有不可替代的作用，机械分离的神经元较原代培养的神经元保存有更好的生理通道机制，而通常用来进行机械分离实验的小鼠多为2－3周龄（幼年），老年小鼠大脑结构致密，基本不可能进行机械分离，从而给不同年龄小鼠神经递质受体机制的比较带来困难。   

发明内容

本发明的目的是提供一种将原代培养的化学分离方法融入到机械细胞分离中，将脑切片预先用木瓜蛋白酶处理，可对中年及老年小鼠的健康神经元进行分离的方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

成年小鼠神经元的机械分离方法，包括以下步骤：

步骤a：在冰浴组织培养液中采用电子振动切片机制作350-375m厚的成年小鼠脑组织切片，室温条件下保存30-60分钟，备用；

步骤b：于无菌条件下，将步骤a中的脑组织切片放入含有木瓜蛋白酶的组织培养液中，控制温度为32.2-35.3℃，保存30分钟，备用； 

步骤c：将脑切片置于盛有HEPES缓冲液（pH=7.4）的细胞培养皿内，选择所需分离的神经区域，使用细胞分离器分离神经元，频率为50-60Hz，摆动幅度2-4mm，分离针移动速度0.8-1.5mm/s；

步骤d：筛选健康神经元；筛选标准为：1）细胞轮廓光滑；2）在显微镜倒置光源下，透亮；3）有突触。

作为优选，所述的组织培养液中各成分的最终浓度：125.0mM NaCl、5.0mM KCl、1.24mM KH₂PO₄、26.0 mM NaHCO₃、2.4 mM CaCl₂、1.3 mM MgSO₄、10.0 mM葡萄糖；控制用量为150-200ml每只小鼠。

作为优选，所述的HEPES缓冲液中各成分的最终浓度：150mM NaCl、5.0mM KCl、2.0mM CaCl₂、1.0mM MgCl₂、10.0mM Hepes、10.0mM D-葡萄糖；控制用量为每片脑组织切片2.5-3.3ml。

作为优选，所述的组织培养液中的木瓜蛋白酶的含量为18U/ml。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

本发明通过将原代培养的化学分离方法融入到机械细胞分离中，将脑切片预先用木瓜蛋白酶处理，使中年及老年小鼠的健康神经元可以通过机械分离得到，本方法简单方便，分离效果显著，具有很高的实用性。

附图说明

图1是显微镜下未经木瓜蛋白酶预处理的2周龄小鼠脑切片神经元图谱。

图2是显微镜下未经木瓜蛋白酶预处理的10周龄小鼠脑切片神经元图谱。

图3是显微镜下经木瓜蛋白酶预处理的10周龄小鼠脑切片神经元图谱。

图4是经木瓜蛋白酶和未经木瓜蛋白酶处理的荧光定量分析统计结果对比图。

具体实施方式

下面结合附图1至附图4与实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1

 小鼠海马切片的制备与预处理：14－20天大的C57BL/6小鼠，用戊巴比妥钠（80mg/kg）麻醉后断头。快速在冰浴(4℃)组织培养液(单位mM： 125.0 NaCl, 5.0 KCl, 1.24 KH2PO4, 26.0 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 1.3 MgSO4, 10.0 glucose)（控制用量50－100ml）中制作350-375μm厚的组织切片(电子振动切片机 VT1000S，Leica)。机械分离前，切片先在室温（24－32℃）组织培养液（100ml）中保存30分钟，再在含木瓜蛋白酶(Papain, 18U/ml, 32.2-35.3℃)的组织保存液中保存30分钟后（可通过计算，直接将木瓜蛋白酶加入组织保存液中，调整至目标浓度及目标温度（32.2-35.3℃)，再进行机械分离。