[发明专利]PAlb-uPA慢病毒载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及PAlb-uPA慢病毒载体，还涉及PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法和应用。

背景技术

除人和灵长类动物外，人肝炎病毒并不存在天然的小动物感染宿主，这严重阻碍了对人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物的研究。目前只有黑猩猩是研究人肝炎病毒感染最好的体内实验模型，但使用受保护的稀有灵长类动物受到伦理学及经费等诸多限制。因此建立廉价易得的小动物模型是亟待解决的难题。近年发展起来的能携带人肝组织的小鼠动物模型为肝炎病毒感染机制和抗病毒药物研究提供了良好的平台。经研究发现尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，是携带人肝组织的理想小鼠动物模型。但是通过转基因方法获得的尿激酶型纤溶蛋白酶转基因小鼠，子代新生小鼠死亡率高、筛选难度大，大大阻碍了人嵌合肝小鼠模型的构建、推广和使用。

因此，急需一种PAlb-uPA慢病毒载体，既能对体内组织，又能对体外培养细胞进行感染，可以用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，提供携带人肝组织的受体小鼠。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供PAlb-uPA慢病毒载体，白蛋白启动子PAlb调控四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2特异表达于肝脏中，四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2在含有四环素类化合物的条件下作用于含四环素操纵子的PTight启动子，最后通过PTight启动子调控尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达，由白蛋白启动子PAlb和四环素操纵子受双重控制，组织特异性高，调控方便，灵敏。

为实现上述发明目的，技术方案为：

所述PAlb-uPA慢病毒载体含有白蛋白启动子PAlb、尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA、白蛋白启动子PAlb启动的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2和启动尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的PTight启动子，所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2调控所述PTight启动子；

所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2的核酸序列如SEQ ID NO.10所示；PTight启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

进一步，所述PAlb-uPA慢病毒载体具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。

本发明目的之二在于提供PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其制备方法简单，其技术方案为：

PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，具体步骤如下：

a．从小鼠肾脏克隆尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，并将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的PTight 启动子下游，得JGY-PLV-2载体；

b. 克隆白蛋白启动子PAlb，并将克隆的白蛋白启动子PAlb连入pLVX-Tet-On载体的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2的上游，得JGY-PLV-1载体；

c.从步骤b所得JGY-PLV-1载体上切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用子rtTA/rtTA2^S-M2的片段，然后连入pLKO.1克隆载体，得JGY-PLV-A载体；

d.从步骤c所得JGY-PLV-A载体切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的片段，然后连入步骤a所得JGY-PLV-2载体的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA下游，得PAlb-uPA慢病毒载体。

进一步，所述步骤a中，将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA用XbaI和BamHI酶切，连入同样经XbaI和BamHI酶切的pLVX Tight Puro载体，得JGY-PLV-2载体。

进一步，所述步骤a中，尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的克隆，具体为：以C57小鼠肾脏第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物，进行第一次PCR扩增；再以第一次PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物进行第二次PCR扩增，得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。