[发明专利]PAlb-uPA慢病毒载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.PAlb-uPA慢病毒载体，其特征在于：所述PAlb-uPA慢病毒载体含有白蛋白启动子PAlb、尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA、白蛋白启动子PAlb启动的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2和启动所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的PTight启动子，所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2调控PTight启动子；

所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2的核酸序列如SEQ ID NO.10所示；PTight启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.根据权利要求1所述的PAlb-uPA慢病毒载体，其特征在于：所述PAlb-uPA慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.权利要求1或2所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

a．从小鼠肾脏克隆尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，并将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的PTight 启动子下游，得JGY-PLV-2载体；

b. 克隆白蛋白启动子PAlb，并将克隆的白蛋白启动子PAlb连入pLVX-Tet-On载体的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2的上游，得JGY-PLV-1载体；

c.从步骤b所得JGY-PLV-1载体上切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用子rtTA/rtTA2^S-M2的片段，然后连入pLKO.1克隆载体，得JGY-PLV-A载体；

d.从步骤c所得JGY-PLV-A载体切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的片段，然后连入步骤a所得JGY-PLV-2载体的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA下游，得PAlb-uPA慢病毒载体。

4.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤a中，将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA用XbaI和BamHI酶切，连入同样经XbaI和BamHI酶切的pLVX Tight Puro载体，得JGY-PLV-2载体。

5.根据权利要求4所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤a中，尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的克隆，具体为：以C57小鼠肾脏第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物，进行第一次PCR扩增；再以第一次PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物进行第二次PCR扩增，得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。

6.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤b中，将克隆的白蛋白启动子PAlb用ClaI和BamHI酶切，连入同样经ClaI和BamHI酶切的pLVX-Tet-On载体，得JGY-PLV-1载体。

7.根据权利要求6所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤b中，所述白蛋白启动子PAlb的克隆，具体为：以含白蛋白启动子PAlb的质粒为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR扩增，得白蛋白启动子PAlb。

8.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤c为将步骤b所得JGY-PLV-1载体用AgeI和AvrII酶切，回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2片段，然后连入同样经AgeI和AvrII酶切的pLKO.1克隆载体，得JGY-PLV-A载体。

9.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤d为将步骤a所得JGY-PLV-A载体用AgeI和XhoI酶切并回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2片段，然后连入同样经AgeI和XhoI酶切的JGY-PLV-2载体中。

10.权利要求1所述PAlb-uPA慢病毒载体在制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。