[发明专利]一种二点委夜蛾的分子鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫种类鉴定的DNA序列，具体涉及玉米新害虫二点委夜蛾的DNA序列及其分子鉴定方法。 

背景技术

二点委夜蛾[Athetis lepigone（M?schler，1860）]是我国夏玉米产区新发生的一种农业害虫。 

据有关资料记载，国内最早于2005年7月在河北省石家庄地区发现二点委夜蛾危害夏玉米苗，钻蛀茎基部，导致幼苗枯心萎蔫死亡，或咬断玉米根，导致倒伏，造成严重的缺苗断垄，这在国内属于首次报道。据报道，2010年二点委夜蛾在河北省中南部夏玉米区普遍发生，2011年在河北、河南、山东、山西、安徽、江苏等省暴发，发生面积达3000多万亩，少数地块补种或毁种，是近年玉米生产中少见的严重虫害。 

由于二点委夜蛾是近几年才引起人们关注的新发生害虫，对该害虫的认识还不够，在发生较轻的地方，人们不会注意观察，就认为是地老虎，根本意识不到这是一种新害虫，而在发生严重地区，农业技术人员和农民经过仔细观察，还常会把它误认为是地老虎，延误或使用了不当的防治措施，给生产造成损失，针对于此，在已有的形态特征描述的基础上，本发明的目的就是要提供一种二点委夜蛾的基因片段，用于二点委夜蛾的准确鉴定。 

生物体的线粒体基因组（mtDNA）严格遵守母系遗传，几乎不发生遗传重组，能够全面反映种群内和种群间的遗传变异，且其结构简单，进化速率快，因而被广泛应用于探索种群结构和遗传多样性的研究 （Norgate et al., 2009）。 其中细胞色素氧化酶C亚基（COI）基因在脊椎动物和无脊椎动物种类鉴别、群体遗传多样性和分子系统进化学等研究方面均得到广泛应用（Novo et al., 2010； Feng et al., 2011；Xu et al., 2011）。COI 基因能够用于研究昆虫各类群系统发育关系和进化以及验证传统分类系统，建立物种的自然系统和进化关系，有助于物种的区别鉴定、发现隐存种、研究物种分化和遗传多样性（梁日霞等，2011；池宇等，2010；杨宝山等，2009；Collet et al., 2006）。 

发明内容

本发明的目的就是针对实际生产中容易把二点委夜蛾与地老虎混淆，提供一种二点委夜蛾的基因片段，用于二点委夜蛾的准确鉴定。 

本发明提供一种二点委夜蛾COI基因的DNA序列，其包含如下SEQ ID NO:1所示的序列（GenBank登录号JQ395055）或与SEQ ID NO:1所示序列具有至少99%序列同一性的序列。 

本发明还提供一种二点委夜蛾种类的分子鉴定方法，其特征在于包括如下步骤： 

（1） 收集昆虫样本：采集的样品放于95%乙醇中，－20℃保存；

（2）基因组DNA的提取：按照动物组织/细胞基因组快速提取试剂盒提取昆虫基因组DNA，保存于-20℃备用；

（3）COI基因的扩增、克隆、测序及序列分析，其中COI 基因序列的PCR 扩增引物： 上游引物/下游引物5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3/5-TAAACTTGAGGGTGACCAAAAAATCA-3；

（4）测序结果表明ZB1～ZB17为二点委夜蛾不同单倍型，与ZB1（JQ395055）相似度均达到99%以上。

在本发明的分子鉴定方法中，COI基因扩增的具体步骤为： 

20μL的PCR反应体系：PCR扩增总反应体系为20μL，其中模板DNA 2.0μL、上下游引物各1μL(浓度10μM)、10×PCR buffer 2.0μL、dNTP 1.6μL（2. 5 mM）、酶 0.3U、超纯水补足；

反应程序：94℃、5min；35个循环（94℃、45s，54℃、45s，72℃、1min）；72℃延伸5min；用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并回收目的条带。

在本发明的分子鉴定方法中，按照TaKaRa试剂盒上的步骤把切胶回收的PCR产物与PMD19-T载体连接，把阳性克隆的菌液测序。