[发明专利]一种二点委夜蛾的分子鉴定方法

权利要求书

1.一种二点委夜蛾种类的分子鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：

（1） 收集昆虫样本：采集的样品放于95%乙醇中，－20℃保存；

（2）基因组DNA的提取：按照动物组织/细胞基因组快速提取试剂盒提取昆虫基因组DNA，保存于-20℃备用；

（3）COI基因的扩增、克隆、测序及序列分析，其中COI 基因序列的PCR 扩增引物： 上游引物/下游引物5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3/5-TAAACTTGAGGGTGACCAAAAAATCA-3；

（4）测序结果表明ZB1～ZB17为二点委夜蛾不同单倍型，与ZB1（JQ395055）相似度均达到99%以上。

2.根据权利要求1所述的二点委夜蛾种类的分子鉴定方法，其特征在于COI基因扩增的具体步骤为：

20μL的PCR反应体系：PCR扩增总反应体系为20μL，其中模板DNA 2.0μL、上下游引物各1μL(浓度10μM)、10×PCR buffer 2.0μL、dNTP 1.6μL（2. 5 mM）、酶 0.3U、超纯水补足；

反应程序：94℃、5min；35个循环（94℃、45s，54℃、45s，72℃、1min）；72℃延伸5min；用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并回收目的条带。

3.根据权利要求2所述的二点委夜蛾种类的分子鉴定方法，其特征在于

按照TaKaRa试剂盒上的步骤把切胶回收的PCR产物与PMD19-T载体连接，把阳性克隆的菌液测序。

4.根据权利要求3所述的二点委夜蛾种类的分子鉴定方法，其特征在于： 

先利用Sequencher_v4.1.4软件读取测序的序列，观察峰值进行反复校对，利用DNAMAN_v6、ClustalX1.81软件对测得的序列与JQ395055所示的序列进行多序列同源比对；此外，根据MEGA5.05建树模型，以夜蛾科的小地老虎（Agrotis ipsilon）COI基因做为外群，用邻近法构建单倍型系统树，并利用p-distance计算各单倍型之间的遗传距离；结果表明与JQ395055相似度高达99%以上的即可认为该昆虫为二点委夜蛾。

5.将权利要求1所述的方法用于快速区分鉴别二点委夜蛾的用途。

6.一种用于鉴定二点委夜蛾种类的引物，其特征在于序列为：5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3/5-TAAACTTGAGGGTGACCAAAAAATCA-3。

7.将权利要求5所述的引物用于鉴定二点委夜蛾种类的用途。

8.一种包含权利要求5所述引物的试剂盒。