[发明专利]一种树干毕赤酵母基因组规模代谢网络模型构建及分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以整合基因组注释技术为核心的树干毕赤酵母基因组规模代谢网络模型构建方法及对构建所得模型的分析方法，属于系统生物学领域。

背景技术

人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的到来，后基因组时代各种高通量的组学技术的发展使的生物学的研究从传统的分子生物学进入到系统生物学时代，而基因组规模代谢网络模型(Genome Scale Metabolic Model)无疑是研究热点之一。继流感嗜血杆菌基因组规模代谢网络模型构建完成，迄今已有80多个不同物种的基因组规模代谢网络模型被公布。基因组规模代谢网络模型就是将细胞内所有的生化反应看作一个整体，在系统水平上研究所有参与代谢过程的基因、酶和反应物之间的相互作用。根据拟稳态的假设，代谢网络处于一种瞬时平衡稳态，运用模拟算法可得到完整的细胞代谢流分布图，揭示细胞代谢变化规律，为代谢工程改造和生理生化代谢特点解析提供依据。

作为一种非传统型酵母，树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis CBS6054)因其宽广的碳源代谢能力而成为纤维素乙醇的潜在生产菌。由于自然环境的进化选择，树干毕赤酵母不仅可以利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖等六碳糖，还可以发酵木糖、阿拉伯糖等酿酒酵母不能利用的五碳糖，甚至可以代谢纤维二糖、木聚糖等。在其已公布的全基因组测序结果中也证实了大量糖代谢相关基因的存在。此外，树干毕赤酵母利用木糖发酵产乙醇的得率最高已达0.47g/g木糖，并且利用树干毕赤酵母发酵还具有营养要求简单、抗污染能力强等优点。然而，工业化应用也存在许多不可避免的问题，如底物吸收较低，发酵乙醇需要严格控制溶氧水平等。因此，我们需要在系统层面上研究树干毕赤酵母的代谢机理，为树干毕赤酵母更为广泛的应用提供一个有效的平台。

常规的基因组规模代谢网络模型构建以公布的基因组测序结果为信息源提取具有代谢功能的基因，再整合生化数据库信息，进而组合成能代表此微生物细胞内发生的所有已知生化反应的反应列表。本发明提出的是一种半自动化的整合微生物基因组规模代谢网络模型构建方法。运用此方法进行代谢网络模型构建的优点是更加省时、方便，且所得模型更为全面、准确。

发明内容

本发明的目的是提供一种树干毕赤酵母基因组规模代谢网络模型构建及分析方法。

本发明的技术方案：

1.基因组规模代谢网络模型构建与分析包括全基因组注释与粗略模型的构建、模型的精炼、数学模型的建立、模型的验证与分析四个步骤。

1)全基因组注释与粗略模型的构建：首先从Uniprot、NCBI Entre Gene或者EBI等公共数据库平台上下载最新的FASTA格式基因组序列，后采用多种全自动化的基因组注释方法，包括在线数据库KAAS(KEGG Automatic Annotation Server)、IdentiCS、和位点特异比对(PSI-BLAST)对特定的全基因组序列进行整合注释得到关于目的微生物全面的代谢基因信息，构建出以基因-蛋白质-反应关联为核心的粗略代谢网络模型。

2)模型的精炼：模型精炼的主要目标是通过整合生化数据库和文献组学的数据来建立物种特异的详细反应列表，具体工作包括验证补充基因-蛋白质-反应关联信息，添加必要的运输交换反应，文献信息的挖掘与补充，生物量方程及能量维持反应的建立等。

3)数学模型的建立：将上述反应列表转换成数学模型，其核心内容是计量系数矩阵，通常用S表示。在安装COBRA工具箱之后，通过加载Matlab程序可将精细代谢模型转换成系统生物学语言格式的文件(SBML)后可在计算机上模拟。为使模拟结果更加接近微生物真实的代谢通常要添加一定的约束条件如代谢通量平衡(S·v＝0)、热力学平衡(ΔE＝0)等。

4)模型的验证与分析：基于约束条件的模拟优化方法是基因组规模代谢网络模型常用的模拟算法，而通量平衡分析(FBA：Flux Balance Analysis)是Matlab平台上最常用的算法，通过函数调用和COBRA工具箱的使用，模拟微生物在特定条件下的代谢状况。

2.树干毕赤酵母的基因组规模代谢网络模型。

基于上述原理，构建获得树干毕赤酵母基因组规模代谢网络模型iTL779，注释出的具有代谢功能的779个基因占树干毕赤酵母总基因的13.2％。运用通量平衡分析方法证实模型的准确性后，运用COBRA单基因、单反应敲除程序鉴定出树干毕赤酵母细胞生长所需的最小基因、反应集合分别为110个基因和158个反应。

附图说明