[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproduct ive and Respiratory Syndrome，PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproduct ive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。自1987年发现至今，已波及世界各地，给养猪业带来了极大的损失。据报道，PRRS在国内大部分养猪地区都有流行，感染率达到58％以上。血清学检测是制定和实施PRRS防制措施的关键环节。因此，研制PRRSV血清抗体检测试剂盒的临床需求日益迫切，而检测猪PRRSV特异性IgM抗体为早期诊断该疾病提供了新的方法。

根椐病毒基因组的差异，可将PRRSV分为以Lelystade株为代表的欧洲型毒株和以ATTC-VR-2332为代表的美洲型毒株。我国分离到的毒株经核苷酸序列分析表明为美洲型。

目前，已经建立了许多先进实用的诊断和检测PRRS抗体和PRRSV抗原的方法，如间接免疫荧光试验(IFA)、免疫过氧化物酶单层试验(IPAM)、血清中和试验(SN)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、RT-PCR方法等。尽管这些方法可以检测PRRSV或抗体水平，但极少检测PRRSV IgM抗体。国外已有的检测猪IgM抗体的试剂盒主要用于检测猪IgM抗体，而不能检测特异性抗原的抗体，即检测抗何种病原的抗体，如PRRSV IgM抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述检测用抗原为纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗PRRSV抗体酶结合物。

本发明的优选技术方案中，所述的包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔包被猪IgM单克隆抗体的包被量为0.1μg-1μg/孔，包被稀释液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的pH9.6。

本发明的优选技术方案中，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃。

本发明的优选技术方案中，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的BSA、质量浓度为1-10％的脱脂牛奶的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液由质量浓度为0.1-10％牛血清白蛋白(BSA)和含有0.01-0.05％NaN₃的磷酸盐缓冲液(PBS)组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。

本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液为含有0.5v/v％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。

本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液为含有0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。

本发明的优选技术方案中，所述终止液为1mo l/L H₂SO₄溶液。

本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液的配制为：配制pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN₃，使其浓度分别为0.1-10％BSA和0.01-0.05％NaN₃，即得。

本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液的配制为：在0.1mol/L PBS溶液中加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5v/v％。

本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，其配制为：称取100mg TMB，将其加入到10mi二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。