[发明专利]利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种转BT基因甘蔗的检测引物对、检测试剂盒及利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法。

背景技术

甘蔗螟虫是我国蔗区广泛发生而且为害很大的一类甘蔗害虫。据估计，因螟害造成甘蔗减产达10%-25%，重者可达40%-60%，同时还可导致糖分损失和诱发某些茎部病害。我国蔗区常见的甘蔗螟虫有二点螟、条螟、黄螟、大螟和白螟等。一直以来，喷施农药都是防治甘蔗螟虫主要手段。但长期大量使用化学农药，既增加了生产成本，又严重污染了环境、破坏了生态平衡。而且螟虫的发生和为害并未得到有效的控制。实践证明，选育和推广抗虫甘蔗品种是解决甘蔗生产发展与环境污染问题的理想措施。但是甘蔗种质自身缺乏抗虫基因，传统的育种方法未能取得进展。随着生物技术的飞速发展，通过转基因技术已经能够有效地向作物导入外源目的基因。目前Bt基因已成为世界上植物抗虫基因工程研究和应用最多的基因。近年来Bt基因也成功引入了甘蔗作物当中，广州甘蔗糖业研究所在国内率先获得了一批表达量高、抗螟性好的转Bt甘蔗品系。优良的Bt材料必须作为种质不断地进行杂交利用，才能选育出符合生产发展需要的抗虫甘蔗品种。而在整个育种过程中，不管是当代转Bt基因植株还是其转育后代，都必须经过真假鉴定，剔除非Bt基因植株。鉴定工作越靠前，节省人力物力就越多，抗虫品种的选育效率越高。

目前Bt基因甘蔗的主要鉴定方法有PCR检测、Western Blot分析、人工接虫试验等鉴定方法。但Western Blot法需要制定特定的抗体，分析过程非常复杂；人工接虫试验需要在特定的时间季节采集虫源，而且植株的数量、大小有一定的要求；而PCR方法具有简便、快速、高通量等优点，无疑是Bt基因植株初步筛选的首选方法，但一般要等植株生长几个月达到一定的高度后，才能采集叶片等组织提取DNA进行鉴定，在一定程度上伤害了植株，又要耗费大量时间等候，延误了实验工作。另外甘蔗叶片含有非常丰富的酚类、多糖等物质，对DNA的提取质量有负面影响，因此都要设法去除，否则直接干扰PCR结果，可见利用叶片提取DNA相对复杂。本发明以PCR扩增技术为基础，根据Bt基因特殊序列区设计引物，不用事先提取基因组DNA，以含酚类、多糖较少的根尖作鉴定材料,用量极少，容易获得，检测过程简单、快速，结果准确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测转BT基因甘蔗的引物对。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测转BT基因甘蔗的试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种转BT基因甘蔗的检测引物对，其序列如下所示：

F1:5’ATG GGA CGC CTT CCT GGT G 3’（SEQ ID NO：1）；

R1:5’TCC TGG AGT CGT AGT TCG GG 3’ （SEQ ID NO：2）。

一种转BT基因甘蔗的检测试剂盒，包括反应液Ⅰ、反应液Ⅱ和反应液Ⅲ，其中，

反应液Ⅰ含有0.1~0.2M NaOH、10~15%(v/v)Tween20；

反应液Ⅱ含有0.1~0.3M Tris-HCl、2~3mM EDTA (pH2.0)；

反应液Ⅲ含有0.28~0.35μM 上述的转BT基因甘蔗的检测引物对（F1、R1的摩尔浓度比为1：1）、0.2~0.3mM dNTP、3.5~4.5mM MgCl₂、0.020~0.03U /μL Taq酶和匹配的缓冲液。

优选的，反应液Ⅱ含有0.1M Tris-HCl、2mM EDTA (pH2.0)。

优选的，反应液Ⅲ含有0.32μM 权利要求1所述的引物对（F1、R1的浓度比为1：1）、0.25mM dNTP、4.0mM MgCl₂、0.020~0.03U /μL Taq酶和匹配的缓冲液。

优选的，所述缓冲液含有100mM Tris-HCl (pH8.8)，500mM KCl，0.8%（v/v）乙基苯基聚乙二醇。

利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法，包括如下步骤：

1）取待检甘蔗根尖，压碎；

2）加入反应液Ⅰ1~2μL，矿物油4~6μL，95~98℃加热10~18分钟；